结果可靠 灵敏度较高
酶联免疫斑点法 ELISpot(Enzyme-Linked Immunosorbent pot)
操作流程
第一天
第1步 将待测细胞加入已包被捕获 抗体的孔中，根据检测指标确定 具体的孵育时间
第二天
第2步 洗去细胞，分 泌的细胞因子被抗体 捕获
第3步 加入生物素 化特异性检测抗体
可自由组合检测指标，更灵活 操作简单，节约成本 细胞因子与疾病 所需标本量少：25ul 适用标本范围广 灵敏度高，检测范围宽
Luminex检测原理
IL-2
IL-4
TNFa
GmCSF
技术优势
多元分析，可以节约试剂、时间和精力。 所需标本量少，尤其适合于分析稀有样本 开放性实验平台，即Luminex仪器可用于免 疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配 体识别分析等研究
IL-8
细胞因子的免疫学检测
ELISA 方法 ELISpot方法
胞内染色流式检测方法
可溶性蛋白流式高通量检测 Luminex技术
酶联免疫吸附实验
（ELISA，Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay-)
细胞因子ELISA检测
夹心ELISA（Sandwich ELISA）：定量检测标本中的 目的抗原。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但 增加了操作步骤和测定时间。 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗特定 抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法 竞争ELISA（Competitive ELISA）：用于确定抗原特 异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异 性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗 原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子 抗原。
（4）治疗移植排斥
IL-2、IL-3、IL-6、GM-CSF等： 骨髓移植 抗IL-2受体γ链McAb ：移植排斥
（5）治疗造血系统疾病
CSFs ： 造血功能异常 EPO ： 肾性贫血 M-CSF：白细胞减少
部分用于临床的细胞因子
EPO: 恶性肿瘤或化疗导致的贫血、慢性肾功衰竭导致的贫血、 失血后贫血。 G-CSF: 化疗导致的粒细胞减少症、自身骨髓移植、白血病、再生 障碍性贫血、AIDS。 GM-CSF: 化疗导致的血细胞减少症、自身骨髓移植、再生障碍性 贫血、AIDS、MDS。 IFN-α: 恶性肿瘤、白血病、肝炎、AIDS、Kaposi肉瘤 IFN-β: 多发性硬化症 IFN-γ: 恶性肿瘤、类风湿关节炎、感染性疾病、 慢性肉芽肿过敏 性皮炎、生殖器疣 IL-2: 恶性肿瘤、免疫缺陷、疫苗佐剂 IL-11: 恶性肿瘤、化疗导致的血小板减少症 sTNFR-I: 类风湿关节炎
(3) 自身免疫性疾病
如：IFN-γ、IL-2等细胞因子。
细胞因子与疾病的诊断及治疗
诊断 --- 缺少特异性
IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ等缺失 --- T细胞活化及功能缺陷 TNF-α（血清）↑--- 类风湿关节炎、感染性休克等
IL-1、IL-6及TNF-α（关节囊滑液）↑ --- 类风湿关节炎
所需试剂
细胞表面染色抗体
固定液、破膜剂
细胞因子抗体
刺激剂
可溶性蛋白流式高通量检测法 （FlowCytomix技术）
操 作 流 程
细胞因子与微球上包被的捕 获抗体结合
荧 光 素 标 记抗 体 与 上 述抗 原-抗体复合物结合
形成抗体-抗原-抗体夹心 复合物
技术优势
高通量：可使用96孔板，每个标本可同时检测多达 10个指标
细胞内染色流式检测法
胞内染色
细胞内染色流式分析法是用细胞经刺激
活化后分泌细胞因子，用特异性抗体与细胞
内特定细胞因子标志结合，即可检测不同细
胞亚群细胞因子的分泌。
操作步骤
细胞表面抗原染色
刺激细胞（PMA、Ionomycin、BFA）
固定、破膜
细胞因子染色
技术优势
快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验 流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便； 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子 ，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型， 进行多参数相关分析； 安全：减少样本处理与生物源性污染 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更 准确反映了体内状况。
IL-2 ：肾细胞癌、黑色素瘤 IL-1～8、IL-10、IL-12、G-CSF、IFN-α、IFN-γ、TNF-α等(转基因)： 多 种肿瘤。
（3）治疗自身免疫性疾病
IFN-β： 多发性硬化症（MS） IFN-γ、IL-1的抑制剂和TNF-α的McAb：类风湿性关节炎(RA） 抗IL-6 McAb： SLE
第三天
第4步 加入 碱性磷酸酶 －链亲和素
第5步 加入底 物，形成斑 点
第6步 斑点计 数，数据分析
实验结果
细胞刺激后结果
未刺激细胞对照
IFN-g ELISpot试剂盒分析人PBMC结果
人PBMCs使用calcium ionomycin和PMA刺激过夜后使用 IFN-g ELISpot试剂盒（目录号EL285）分析的结果
易操作 样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进 行快速、客观的分析
应用领域
B细胞杂交瘤的筛选 化合物和药物免疫学反应的检测 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 靶向疫苗的质控 自身免疫疾病的诊断和预后分析 自身免疫疾病免疫治疗的监控 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 器官移植中排斥反应的预测 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 结核病的诊断
IL-1（血清）↑--- 慢性血清病、免疫复合物肾病等 sIL-2R（血清）↑--- 白血病、多发性硬化、 AIDS、移植排斥反应等
治疗
治疗方式： A. 细胞因子补充疗法 B. 细胞因子阻断疗法 （1）治疗炎症反应
IFN-α：疱疹性角膜炎、乙型肝炎等 IL-10：类风湿性关节炎
（2）治疗恶性肿瘤
细胞因子与疾病的发生
参与感染引起的炎症反应 如: TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等细胞子。 促进肿瘤细胞生长和转移 如：TGF-β、IL-10 、IL-6等细胞因子。 介导移植排斥反应
如：IL-2、IFN-γ等细胞因子。
介导免疫性疾病
(1) 免疫缺陷 如：IL-2受体γ链基因(X染色体)突变 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15等细胞因子功能障碍。 (2) 超敏反应 如：IL-4、 IFN-γ等细胞因子。
细胞因子及检测方法
细胞因子概述
细胞因子是一类由免疫细胞和某些基质细胞分泌的低 分子量糖蛋白。 它参与调节机体免疫反应、生血造血功能、细胞与细 胞间的交流以及宿主对感染、炎症的反应等。 研究细胞因子有助于阐明分子水平的免疫调节机制， 有助于疾病的预防、诊断和治疗, 具有非常广阔的应 用前景。
细胞因子分类
细胞因子的结构
不同细胞因子之间在结构上有很大差异，多数细胞 因子为小分子多肽，分子量不超过60KD，多由100个左 右的氨基酸组成。不同细胞因子之间无明显的氨基酸 序列同源性。
多数细胞因子以单体形式存在，少数因子如IL-5、 IL-12、M-CSF、TGF-β等以双体形式存在。
绝大多数因子带有糖基，糖基多与细胞因子的生物 活性无关，可能起延长细胞因子体内半衰期的作用。
第1步，包被捕获抗体到96孔板中， BSA阻断后加入标准品或者标本
第2步，加入酶标的抗体，结合被捕 获的细胞因子
第3步，加入酶的底物显色，酶标 仪或者化学发光议读取结果
第4步，绘制标准曲线，计算标本中 细胞因子的含量
技术优势
检测细胞因子的传统方法
操作较简便，无需昂贵的仪器设备
可供选择的品种齐全
白细胞介素 (interleukin,IL) 集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF) 干扰素 (interferon,IFN) 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF） 淋巴因子（lymphokine） 单核因子（monokine）
ELlSpot技术优势
可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力 计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例
有效、快速、灵敏度高
使用高吸附性的ELISPOT培养板，淋巴细胞分泌的细胞因子直 接与培养板上吸附的包被抗体相结合 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍