环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。

2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。

3.练习单菌落划线分离微生物。

二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。

而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。

温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。

微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。

粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。

常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。

根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。

常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。

许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。

不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。

产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。

青霉素主要抗G＋细菌。

链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。

链霉素以抗G－细菌为主。

紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。

另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。

紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。

紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。

紫外线对于人体也有伤害作用。

紫外线对细菌生长的影响是随着紫外线对微生物照射剂量、时间及距离的不同，对微生物的生理活动也相应地产生不同的效果：剂量高、时间长、距离短就易杀死它们，剂量低、时间短、距离长时就会有少量个体残存下来，其中一些个体的遗传特性发生了变异。

我们可以利用这种特性来进行灭菌或菌种选育工作。

紫外诱变最有效的波长仅仅是在253～265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。

三、实验仪器、材料和用具紫外照射箱，37℃、33℃、30℃、25℃培养箱25个淀粉培养基平板在一边已长成一直线状菌落的产黄青霉，泾阳链霉菌平板各1个培养18小时的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌菌液，粘质赛氏杆菌的平板无菌的小圆滤纸片、接种环、涂布棒、黑纸、标签纸、酒精灯、记号笔、打火机、试管架、各种规格的移液器及枪头1%稀释的84消毒液，0.05%甲紫，95%乙醇，75%乙醇，1%过氧化氢，2.5%的碘液，5%苯酚，1%甲醛，四、实验步骤1.温度对微生物（粘质赛氏杆菌和未知菌）的影响实验用接种环取培养好的粘质赛氏杆菌单菌落，在3个淀粉平板上分区划线接种，要保证能得到单一菌落。

做好标记，将第一个平板在25℃，第二个在30℃进行培养，第三个在37℃进行培养。

24h后取出，观察不同温度下培养粘质赛氏杆菌生长状况和产生色素情况。

用接种环取培养好的未知菌的单菌落，在3个淀粉平板上分区划线接种，要保证能得到单一菌落。

做好标记，将第一个平板在30℃，第二个在33℃进行培养，第三个在37℃进行培养。

24h后取出，观察不同温度下菌落生长情况判断最适生长温度。

2.化学因素对微生物生长的影响用无菌吸头吸取100μl金黄色葡萄球菌菌液于淀粉培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀。

将上述培养皿用记号笔分成8等份，每一等份内标明一种药物名称。

用无菌镊子将小滤纸片分别浸入各种药剂中，然后对号放入培养皿的小区内。

注意不要造成药品交叉污染。

置37℃温室培养24h后，观察。

比较抑菌圈大小。

3.生物因素对微生物生长影响取已接种产黄青霉和泾阳链球菌并培养48小时的平板各一，在菌苔边缘5毫米处垂直向外划直线接种大肠杆菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌。

37℃培养24小时，观察结果。

4.紫外线的对微生物的影响（紫外线的杀菌效果检验）用无菌吸头吸取100μ1培养18h的金黄色葡萄球菌液于淀粉培养基平板上，以无菌涂棒涂布均匀；用一张纸片遮住部分平板培养基，打开皿盖，置紫外灯下照射3min后取出纸，盖上皿盖。

在黑暗中（或红灯下）用双层报纸包裹，倒置于37℃培养24h后观察结果。

5.紫外线对微生物的诱变效应取摇瓶培养至对数生长期的枯草杆菌菌液0.1ml加入0.9ml生理盐水中，进行10倍稀释，依次做10-1～10-8稀释。

各取100μl菌液涂平板，每稀释度涂2个。

紫外线照射：10-5照射20s，10-4照射30s ,10-3照射40s，10-2照射50s ,10-1照射60s。

以10-6、10-7和10-8平板作对照。

处理后的培养皿在黑暗中（或红灯下）用双层报纸纸包好，倒置37℃培养，24h后观察并记录结果。

五、 实验结果与分析1. 温度对微生物的影响实验表一 温度对粘质赛氏杆菌生长影响的实验结果30℃较深的橙红色分析：由照片可见，细菌的长势良好，可惜没有划出单菌落。

菌体的颜色随着温度产生不同的颜色，说明粘质赛氏杆菌的色素积累速度不同。

25、30℃的时候颜色呈橙红色其中30℃的颜色最深，37℃的颜色偏浅。

说明30℃是粘质赛氏杆菌的较适合温度。

表二 温度对实验服上细菌生长影响的实验结果 培养温度拍照菌落生长情况33℃线较细分析：这三个板是我划的。

由图可见，对未知菌S1的划线分离还是得到了一些单菌落。

由菌落的大小与线的粗细可以看出，未知菌S1在37℃的菌落最大，线最粗，长的菌也最多最密，生长状况最好。

（当然也不排除每次划线蘸取的菌液不等量）。

但这样明显的差异，还是可以说明，37℃是该菌的较适合温度。

2.化学因素对微生物生长的影响表三化学因素对微生物生长影响的实验结果编号化学试剂抑菌圈直径/mm抑菌原理抑菌能力排序1 0.05％甲紫溶液24 结合蛋白质羧基，碱性阳离子染料，对G+菌选择性抑制。

12 2．5%的碘液10 碘和蛋白发生碘化反应。

33 5%苯酚 5 苯酚使蛋白变性、沉淀。

84 1%甲醛7 破坏蛋白质的氢键或氨基75 1%过氧化氢8 强氧化作用 66 1%稀释的84消毒液11 利用次氯酸，破坏细胞膜、酶、蛋白质27 75%乙醇8.5 使蛋白质变性，脱水，溶解类脂58 95%乙醇9 使蛋白质变性，脱水，溶解类脂4滤纸片直径6mm图1化学因素对微生物生长的影响的结果分析：本实验通过测量抑菌圈的直径来分析各种溶液的抑菌能力，实验结果如表中所示。

可知甲紫和84消毒液以及碘酒的消毒能力都较强。

这些化学试剂原理大都为使蛋白质失活，从而破坏细菌的生理活性，使其生长受到抑制。

但由于乙醇极易挥发，而且溶液量不容易控制相等，这应该是本实验的系统误差。

3. 生物因素对微生物生长影响表四 生物因素对微生物生长影响的实验结果平板种类 实验菌种 抑菌程度平板拍照结果产黄青霉大肠杆菌弱枯草杆菌较弱金黄色葡萄球菌较强泾阳链球菌大肠杆菌较强枯草杆菌较强金黄色葡萄球菌强分析：由于菌体生长情况的影响，很难判断具体的抑菌距离，只能通过菌体划线的从前到后的生长情况的变化来判断抑菌能力。

产黄青霉所产生的青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖中交联多肽的合成，对革兰氏阳性菌（枯草杆菌和金黄色葡萄球菌）的效果优于革兰氏阴性菌（大肠杆菌）。

特别是对金葡的抑菌效果较好，这点从图中可以看出，远离产黄青霉的一端金黄色较深，说明金黄色葡萄球菌生长情况较好。

但可能由于枯草杆菌取菌较多，因此抑制现象并不明显，从前到后的差别不大。

大肠杆菌的划线上，从前到后呈正常划线特点，即浓度越来越小，因此青霉素对其抑制效果较差。

泾阳链霉菌产生链霉素能和细菌核糖体的30S 亚基结合，抑制蛋白质合成，所以对革兰氏阴性和阳性菌同样有效。

而由于真核细胞没有30S 亚基，所以链霉素对真核生物没有影响。

由图中可以看出，靠近泾阳链霉菌的一端菌落颜色较浅偏透明，说明链霉素对三种细菌都有抑制作用。

4. 紫外线的对微生物的影响（紫外线的杀菌效果检验）图2 紫外线的对微生物的影响（紫外线的杀菌效果检验）实验结果分析：从图可知，纸片覆盖区域细菌大量生长，菌落密度较高。

而未覆盖区几乎没有菌落存在，表明细菌基本被紫外线杀灭。

此结果说明紫外线确实具有有效的杀菌能力。

原理应该是紫外线引起细菌基因突变，导致一些生长必需的基因发生功能缺失性突变，使得细菌不能正常生长而死亡。

无覆盖区可见少量菌落，可能是变异的菌株，即对紫外线有一定抵抗能力的突变体。

当然，也可能由于紫外线照射不均而生长出的细菌。

5.紫外线对微生物的诱变效应滴加碘液后，淀粉存在的区域遇碘液变蓝，而淀粉被枯草杆菌分解的区域则形成透明圈。

通过菌体数的大小和形成的透明圈的数目来分析紫外线对于微生物的诱变效应。

表六紫外线对微生物的诱变效应的实验结果汇总稀释度照射时间（s）处理后活菌数平均值存活率(%) 致死率(%)平均直径（像素）1 2透明圈菌落HC比值10-160 192*4 丢失768 1.5*10-6 >99.9% 3.64.21.91.92.110-250 274*4 205*4 960 1.8*10-5 >99.9% 4.44.82.22.02.210-340 139 179*4 427 8.4*10-5 >99.9% 5.04.72.01.92.510-430 66 87 77 1.4*10-4 >99.9% 3.8 1.9 2.34.0 1.510-520 313 124 224 2.5*10-2 >99.7% 3.64.51.42.02.410-60 103 77 90 1 0 4.85.01.51.82.910-70 9 25 17 1 0 4.24.02.01.82.210-80 7 10 9 1 0 5.0 2.5 2分析：1)菌落总数通过上表最后三个对照组的数据进行计算。

因其未受到紫外线照射，假设它们的存活率为1，致死率为0。

2)由透明圈直径同菌体直径的比例（HC）的计算结果可知，经过紫外诱变后，细菌的HC值发生了变化，这表明着细菌可能发生了突变，使得菌落产生淀粉酶分解淀粉的能力略有增强。

但数值的变化并不大，实验结果并没有表现出很强的相关性，说实话，我觉得这种差别（再考虑一些随机误差，没有足够的控制变量等等）并不足以说明紫外诱变的效果。

反倒是可以肯定活下来的细菌中存在着某些变异，使得它们可以忍受住紫外线的摧残而生存下来。