铜绿假单胞菌
致病性
• 广泛存在环境中的条件致病菌，是院内感染 主要病原菌 • 可引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、 烧伤感染、囊性纤维变性等 • 有多种毒力因子：包括菌毛、荚膜多糖、内 毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶、磷脂酶 等
• 粘附素：菌毛的神经氨酸酶分解上皮细胞表面的 神经氨酸促进细菌侵入 • 荚膜：多糖类物质抗吞噬细胞的吞噬作用；使细 菌锚泊在细胞表面，与呼吸道感染有关 • 内毒素、外毒素 • 绿脓菌素：绿色色素，由铜绿假单胞菌的RpoS基 因编码产生的代谢产物，具有氧化还原活性的化 合物，能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒氧基 团，引起组织损伤。在致病中起重要作用 • 弹性蛋白酶：降解弹性蛋白，引起肺实质损伤和 出血；降解补体和白细胞蛋白酶抑制物；可与相 应抗体形成复合物，沉积于感染组织中 • 磷脂酶C
• 书本P163 5.26
样 品 10g
10 ml
BL
100 ml
缓冲液
供试 液
10ml
BL 阳性
BL 阴 性 十六烷基三甲基溴化铵平板
培养温度： 36℃
营养琼脂斜面
培养时间： 十六烷基三甲基溴化铵平板 18~24h （必要时可 延长至48h）
增菌培养
供试品
供试液
胆盐乳糖增菌液
36±1℃ 18~24h
嗜麦芽 15%
其他 13%
不动杆菌 16%
铜绿假单胞 菌 56%
非发酵菌分离率
假单胞菌属Pseudomonas
• 共同特点： G-b 菌体细长 单端鞭毛 无芽胞 专性需O2 营养要求不高 35℃生长，少数4℃、42 ℃生长 葡萄糖O/－ 动力+ 氧化酶+ 可产多种色素：绿脓素 荧光素 脓玉红素
各种菌产生的色素
• 绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。
培养基成分：
• • • • •
胆盐乳糖培养基（BL）
胨 20. 0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5. 0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (或去氧胆酸钠） （0.5g) 磷酸氢二钾 4. 0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶 解，调节P H值使灭菌后为7 . 4 ± 0 . 2，煮沸，滤清，加入 乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
• 各种抗生素治疗铜绿假单胞菌所致感染过程中都可 能发生耐药。初代敏感菌株在治疗3－4天后可能发 生耐药，有必要重复分离菌株 • 本菌对多种抗生素天然耐药，常用三代头孢和氨基 糖苷类联合治疗
鉴定结果分析
• 从临床标本中分离出来的铜绿假单 胞菌，需要排除污染因素 • 铜绿假单胞菌下呼吸道感染需连续 三次痰培养阳性才能确立。
菌名 铜绿假单胞菌 荧光假单胞菌 恶臭假单胞菌 斯氏假单胞菌 洋葱伯克霍尔德菌 腐败希瓦讷拉菌 色素 绿脓素、红脓素、青脓素、荧光素 荧光素 荧光素 未定名黄色素 未定名黄色素、紫色素 未定名色素 颜色 蓝、红、黑、黄色 黄绿色 黄绿色 黄色 黄色、紫色 淡红褐色
各种标本
血平板和Mac平板 可疑菌落 涂片革兰染色 革兰阴性杆菌
氧化酶(+)、OF：O 非发酵菌鉴定系统鉴定到种
微生物检验程序
• 生化反应： 氧化酶+ OF：O 硝还+ N 2+ 液化明胶+ 枸橼酸盐+ 精双 水解+ 乙酰胺酶+ 吲哚-
铜绿假单胞菌
电镜图
铜绿假单胞菌
• 抗原： O抗原(外膜蛋白-保护性抗原 脂多糖-型特异性) H抗原 血清学分型 • 抵抗力： 抵抗力强 耐干燥 不耐热 多重耐药 在室温水中长期生存 4℃不生长
铜绿的菌落分型 来自 典型型 大肠菌样型 粘液型 侏儒型 粗糙型
菌落光滑凸起 成粘液状
粘液型（麦康凯平板）
粘液型（血平板）
细小，无光泽 半透明菌落
侏儒型（麦康凯平板）
菌落呈灰绿色 大小不一 扁平湿润 边缘不规则 呈伞状伸展 表面常可见 金属光泽
典型型（麦康凯平板）
产绿脓素 琼脂染成黄绿色
假单胞菌属
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 革兰氏阴性 细胞单个 直的或弯的杆菌 0.5—1 × 1.5—4微米 单鞭毛或多鞭毛 有机化能异养菌 呼吸代谢，永不发酵 严格好氧菌
模式种：铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌
• 1.0.5-0.8*1.5-3.0微米的杆菌 • 2.细胞单个 • 3.成对或成短链。以极生的单鞭毛运动（有 二个或二个以上的极生鞭毛的细胞，但不 常见） • 4.在中性或碱性培养基种呈蓝色：在酸性培 养基种呈红色 • 5.专性好氧，在硝酸盐培养基中除外。
牛胆盐为抑菌剂，用于抑制一些杂菌的生长 。
出处：《中国人民共和国药典》2010版二部 附录 XI J 微生物限 度检查法 P114
培养基成分：
• • • • • • • •
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 胨 10g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g • 溴化十六烷基三甲铵琼脂培 养基是铜绿假单胞菌的选择 氯化钠 5g 性培养基，也是美国药典和 水 1000ml 中国药典等国推荐使用于食 除琼脂外，取上述成分，混合， 品、药品中铜绿假单胞菌检 微温使溶解，调节pH值使灭菌后 测的培养基。 为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化 后，分装，灭菌，冷至60℃，倾 注平皿。 书本P161 5.14
微生物检验
• 采集标本：各种临床标本 医疗器械 环境用品 • 检验方法：直接镜检 分离培养(血平、MAC平板) 鉴定 分型：血清学分型、质粒指纹图谱分型、 脉冲场凝胶电泳分型等
分离培养
• 普平： 扁平 或黄绿 • 血平： 染成蓝 18-24h圆形 大小不一 边缘不整
湿润 常呈融合态 琼脂被染成绿 扁平 湿润 有金属光泽 琼脂被
绿或灰绿 有溶血环 • MACc平：微小无光泽半透明 48h后菌落 呈棕色
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
• 细菌耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗生素泵出胞外 –抗菌药物作用靶位改变 –膜孔蛋白突变 –生物膜屏障作用
• 溴化十六烷基三甲铵——具 有优良的渗透、柔化、乳化、 抗静电、生物降解性及杀菌 等性能。本产品化学稳定性 好， 耐热、耐光、耐压、 耐强酸强碱。
培养基成分： 营养琼脂培养基
• • • • • 胨 10g 牛肉浸出粉 3g 氯化钠 5g 琼脂15~20g 水 1000ml
书本P159 5.2
• （以营养肉汤培养基的处方及 制法）取上述成分，混合，煮 沸溶解后，调节pH值使灭菌后 为7.2±0.2，分装，灭菌。
培养基成分：
PDP斜面，是否有色素，有， 用氯仿3-5ml萃取，用无菌 玻璃棒搅碎培养基、混匀， 色素完全在氯仿层。吸管 把氯仿层移到另一试管， 加入盐酸1M1ml，静置后， 盐酸出现粉红为阳性，无 粉红为阴性，阴性斜面培 养1-2天再重新做一遍。如 果仍是阴性。做下一步试 验。 绿脓菌素从有机相转到酸性 水相中会由蓝绿色变为粉 红色。
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绿脓菌素
• 绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基 (PDP琼脂)
胨 20g 甘油 10ml 氯化镁(无水) 1.4g 琼脂 18~20g 硫酸钾 10g 水 1000ml 取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温 使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1， 加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分 装于试管，灭菌，置成斜面。
菌落特征
感染途径：
当机体免疫功能受损或缺损时，可引起严重的甚至致死性的感染。
1.正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道 内，呼吸道和肠道均有该菌存在，但分离率较低。 2. 医源性感染
3.术后操作感染（气管切开、保留导尿管等）
4.人、病人与病人的接触也为传播途径之一
检查意义：
• 人及动物的皮肤、肠道、上呼吸道等处都有该菌存在。绿脓杆菌抵 抗力较强，湿热55℃1小时才被杀死。 • 对紫外线不敏感。对多种抗生素易产生耐药性。本菌仅于人体防御 功能改变或直接进入机体（如通过泌尿道插管及静脉导管、呼吸道 的通气设备和其他治疗检查方法）以及混合感染时才具有致病性。 • 长期使用抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或大面积烧伤、肾 功能不全、心脏病、慢性支气管肺疾患的患者易继发绿脓杆菌的感 染。
典型型（普通平板上）
菌落中央凸起 边缘扁平 表面粗糙
粗糙型（麦康凯平板）
菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落
大肠型（麦康凯平板）
常见非发酵菌初步分群鉴定
试验 假单胞 不动杆 产碱杆 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属 氧化酶 + + + + 葡萄糖O/F O/O/O/F 动力 + + MAC平板生长 + + + +/-
铜绿假单胞菌
• 形态：G-b 菌体长短不一 球杆状或长丝状 单端单鞭毛 动力+ 无芽胞 • 特性：专性需氧 营养要求不高 35℃+ 4℃－ 42 ℃+ 可形成多种不同形态的菌落 产多种色素(主要为绿脓素、荧光素)
实验室检查及其它检查
• 标本采集 • 采自不同感染部位的各种标本， 包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺 液等。还包括来自医院环境中的各种标 本如水、空气、物体表面采样等。 • 染色镜检 • 为革兰阴性菌，菌体大小（1.5～ 5.0)um×宽(0.5～1)um，细长且长短不 一，有时呈球杆状或线状，成对或短链 状排列。菌体的一端有单鞭毛，无芽胞。
• 本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃， 最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在 4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以 鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水 溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧 光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。在血 平板上会有透明溶血环。 • 该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原 （鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种 是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂 多糖，有特异性。O抗原可用以分型。