型高效液相色谱仪测定川芎含量检验方法验证方案文件编号S-YF-013（01）起草人崔英南日期2012年08月26日审核人日期2012年08月31日批准人李立新日期2012年08月31日生效日期2012年09月01日验证方案审批表目录1再确认目的2再确认范围3再确认责任4内容4.1 概述4.2再确认内容4.2.1再确认小组4.2.2 预确认4.2.3 安装确认4.2.4 运行确认4.2.5 性能确认4.2.6 结果分析与评价4.2.7 再确认周期目的确认经设备确认高效液相，按药典检验方法测定生产品种含量，验证其检验结果科学性、准确性、精密性等，满足检验结果正确性需要，有效控制产品质量。

提供必要的文件以证实本设备的操作与所预期的完全一致。

根据本方案的验证，确认按检验操作规程操作，能有效的保持本设备于确认状态下，能稳定地、恒定地达成其所预期的功能。

范围质量标准、检验操作规程文件的汇集。

验证设备用于含量测定检验方法的准确性在标准范围内验证设备用于含量测定检验方法的精密度可靠性验证设备用于含量测定检验方法，在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物尝试直接呈正比关系的程度。

验证设备用于含量测定检验方法具有专属性。

验证设备用于含量测定检验方法在达到一定精密度、准确度和线性时，其测定值高低限在可控范围内。

验证设备用于含量测定检验方法的耐用性。

责任质量管理部负责验证方案的起草，申请审批，验证过程的监督、资料的存档，再确认方案的执行及再确认结果的评估。

化验室负责实验的操作，原始记录、报告的填写。

验证小组负责验证报告的审核。

内容1 概述：本设备由P3000高压输液泵和UV3000可变波长紫外/可见分光检测器组成。

P3000高压输液泵是以CPLD技术为核心，由单片机控制的高精密输液泵系统。

它基于全数字的频率发生系统、先进的马达驱动系统及友好的人机显示页面似的该设备的操作及控制很方便。

先进的泵头及单项阀设计思路，融汇了当今世界上最先进的经验，使得用户在各种使用条件下都可以保证输液的精度及重复性指标。

UV3000紫外/可见波长检测器是完整的高效液相色谱仪的一个重要的组成部分。

该检测器的设计以当今最先进的技术为先导，通过数字化的数据处理和控制，其基线噪声和漂移降低到一个新的极限。

由于采用了数字量输出功能，该检测器可以与计算机直接通过串行口相连而不需要任何数据采集单元。

该设备已经设计、安装、运行、性能确认，并经过计量校验，在有效期范围内。

通过该设备用于生产品种川芎中阿魏酸的含量测定，验证该设备的准确性、精密性、专属性、线性、范围、及耐用性是否符合要求。

2验证内容2.1验证小组：由厂验证领导小组安排，成立P3000/U3000高效液相色谱仪验证小组。

2.1.1组长：张杰2.2 预确认2.2.1设备基本情况2.2.1.1设备制造商及零件供应商资料设备名称：高效液相色谱仪编号：021型号：制造商：地址：电话：传真：联络人：2.3该设备是否满足GMP及现行生产工艺要求的确认2.3.1检查并确认设备组成的单体结构应完整，并且各单体结构外观应无缺陷性损坏。

2.4 设备确认该设备已经设备的设计、安装、运行、性能再确认，同时该设备经计量校验确认，并在有效期范围内。

2.5 人员、环境、试药的确认化验员已经均经过培训，熟悉方法及使用的仪器，环境湿度为56%，温度为20℃均在合理范围内。

对照品从国家生物检定研究院购置，批号为有效期为其它试剂为色谱纯，水为纯化水均符合试验要求。

3 含量测定3.1准确度验证准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，准确度应在规定的范围内测试。

3.1.1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30：70）为流动相；检测波长为321nm。

理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4000。

流速：1.0ml/min；色谱柱规格：4.6×250mm；粒度：5μm；进样量：10μl。

3.1.2对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.1.3供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.1.4测定法可用上述已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分对照品，在规定范围内，取同一浓度的供试品进行测定。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

同一浓度，用6个测定结果进行评价，应报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差（RSD%）。

用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。

公式：回收率%=（C-A）/B*100%式中A为供试品所含被测成分量；B为加入对照量；C为实测值。

实测值公式：平均值X=∑Xi/n平均偏差=∑│Xi-X│/n平均相对偏差=平均偏差/平均值附图：样品与对照品峰面积见图谱。

加样回收率考察取本品粉末6份，精密称定，按照供试品方法制备，得到供试品溶液各50ml，各加入10ml对照品溶液，摇匀，得到待测溶液，滤过，进样，计算峰面积，得到数据如下表：注意：在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

表1 含量测定川芎加样回收率试验表结果评价：检查人：复核人：日期：年月日3.2精密度验证精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。

精密度一般用偏差，标准偏差或相对标准偏差表示。

同一浓度，用6个测定结果进行评价。

精密度包含重复性，中间精密度和重现性，其中重现性是在不同化验室不同时间进行实验，查看实验结果有没有重现性，本公司只一个实验室此项略。

3.2.1重复性（设操作人员A）在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度称为重复性；3.2.1.1色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30：70）为流动相；检测波长为321nm。

理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4000。

流速：1.0ml/min；色谱柱规格：4.6×250mm；粒度：5μm；进样量：10μl。

3.2.1.2对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

3.2.1.3供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.2.1.4含量测定3.2.1.5计算式中f 为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值； AT 为对照品峰面积；单位μv*sec ； n Ｔ为供试品的稀释倍数； WT 为供试品的称量；单位g 。

3.2.1.5将计算的结果填入下表 表2 含量测定阿魏酸重复性试验表结果评价：检查人： 复核人： 日期： 年 月 日3.2.2中间精密度（换一时间，换一操作人员，设操作人员为B ）TT TTT W A f W n A f g mg 25)/(⨯⨯=⨯⨯=含量在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度称为中间精密度；同一浓度，用6个测定结果进行评价。

3.2.2.1色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30：70）为流动相；检测波长为321nm 。

理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4000。

流速：1.0ml/min ；色谱柱规格：4.6×250mm ；粒度：5μm ；进样量：10μl 。

3.2.2.2对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml 含20μg 的溶液，即得。

3.2.2.3供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0. 5g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml ，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.2.2.4含量测定 3.2.2.5计算 公式：式中f 为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值； AT 为对照品峰面积；单位μv*sec ； n Ｔ为供试品的稀释倍数； WT 为供试品的称量；单位g 。

TT TTT W A f W n A f g mg 25)/(⨯⨯=⨯⨯=含量表3：结果评价：检查人：复核人：日期：年月日3.3线性及线性范围线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物尝试直接呈正比关系的程度。

应在规定的范围内测定线性关系。

可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供应品，以测得的响应信号作为被测物尝试的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。

必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

数据要求：应列出回归方程，相关系数和线性图。

范围系指能达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限尝试或量的区间。

范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。

3.3.1色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30：70）为流动相；检测波长为321nm 。

理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4000。

流速：1.0ml/min ；色谱柱规格：4.6×250mm ；粒度：5μm ；进样量：10μl 。

3.3.2对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml 含20μg 的溶液，即得。

3.3.3供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0. 5g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml ，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

3.3.4含量测定 3.3.5计算 公式：式中f 为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值；TT TTT W A f W n A f g mg 25)/(⨯⨯=⨯⨯=含量AT为对照品峰面积；单位μv*sec；nＴ为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量；单位g。

表4 川芎阿魏酸不同浓度的峰面积结果评价：检查人：复核人：日期：年月日3.4耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。