使用均一的载体 仔细填充柱子 选择粒度小的载体 优化流速 减小进样量 降低系统死体积 降低输出回路响应时间
No.24
第二章 HPLC 仪器工作原理
本章内容：
•往复活塞泵的结构及工作原理 •手动进样器（六通阀）结构及工作原理 •常见检测器检测原理
No.25
溶剂传输系统
往复活塞泵(单向阀)
Gold Seal Sapphire Insert Ruby Ball Spring Insert
60℃
0
5 Time in Minutes
10
No.14
柱效
Detector Response Inject
低柱效
高柱效
Time
No.15
计算柱效
tR
Inject
W 1/2
W Time
B
N = 16
t R WB L N
2 = 5.54
t R W 1/2
2
HETP =
No.16
扩散
范德姆特方程 The Van Deemter Equation
150 4.0
100 3.0 2.0
50
1.0
10
No.6
高效液相色谱 (HPLC)
进样口 混合器 泵 色谱图 色谱柱
检测器
溶剂
No.7
液相色谱类型
Types of Compounds Separated Neutrals Weak Acids Weak Bases
Mode
Stationary Phase
No.31
Necessity for More than One Detector
Selectivity
Flecainide in Serum
UV signal FL signal
Therapeutic concentration: 1.8mg/l, 20ul injected UV and fluorescence signal
第四天
下午：1 考试 2 发结业证 3 自由练习、讨论
No.3
第一章 色谱基础
本章内容：
•液相色谱发展史
•液相色谱的基本概念 •影响峰形扩展的因素
No.4
历史回顾
1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)
碳酸钙吸附剂 石油醚 1940‘s - 分配色谱和纸色谱 1950‘s - 气相, 薄层，凝胶过滤色谱 梯度洗脱色谱 1960‘s - 商业高效液相色谱.
160 180 200 220
200
Wavelength (nm)
250
60
80
100
Mass/Charge
No.33
紫外－可见检测器
根据Beer定律，通过检测池透射光的强度与溶质浓度成正比。
Detector Cell Io C b I
Log
I0 = 入射光强度 I = 透射光强度 A = 吸光度
Photodiode Array (UV/Visible) Light Source Holographic Grating
第二天
上午：1 化学工作站View菜单介绍 2 方法的编辑、修改、存贮及运行 3 Agilent 各部件采集参数设置 4 填写样品信息表、进样分析（实验二） 下午：1 数据处理参数设置 （谱图优化、积分优化） 2 练习 3 谱图处理、手动积分
No.2
第三天
上午：1 各种定量方法原理及其优缺点 2 建立多级外标校正曲线，用外标法定量 3 练习（实验三） 下午：1 建立多级内标校正曲线，用内标法定量 2 再校正、设定报告类型 3 练习（实验四） 4 高级功能简介（序列、DAD光谱功能……） 上午：1 系统日常维护和保养 2 工作站故障诊断功能的应用 3 Agilent 1100泵的维护 （拆泵头，更换泵头消耗品） 4 Agilent 1100检测器的维护（VWD、DAD易耗品的 更换，清洗流通池） 5 练习 结业午餐
溶剂洗脱强度强
2000 1600 mA U 1000 600 0 2 4 Time (min.) 6 8 10
80% Acetonitrile 20% Water
对于反相色谱，增加10％的有机组成等于降低每个色谱峰的K’值的1/2 到2/3。
No.12
分离选择性
(α)
α
= k' B
k' A
A
B
A B
A B
2
3
1
2
1
2
t0=1
α
=
k' B k' A
=
1.64 1.58
=
1.04
α
=
1.15 0.85
= 1.35
α
=
0.95 0.63
=
1.50
改用不同的流动相 改变流动相的组成 改变流动相pH值 改变柱温 应用特殊的化学效应 改变固定相
改变分离选择性α的方法
No.13
温度对分离选择性α的影响
40 ℃
195 190 195 205 210 200-210 310 202, 255 220, 275
-C=CC=O - COOR - CHO - COOH - NO
2
-
max
= wavelength of absorption maximum
No.35
Instrumentation - Absorbance Detectors
R = 1.5
Excellent efficiency Poor selectivity R = 0.5
Excellent efficiency Moderate selectivity
R=4
No.23
如何提高分离度
通过下述方法增加保留时间:
选择合适的分离参数 增加色谱柱长度 增加固定相浓度
通过下述方法降低谱带宽度:
No.30
Necessity for More than One Detector
Sensitivity
UV-signal
WL 241/394
WL 270/388
WL 248/411
WL 302/420
WL 247/504
Fluorescence
Solv.: H2O/CH3OH= 10:90 PAH's extracted from soil; Col.: Sup.LC-PAH 150x4.6mm;
Agilent 1100 化学工作站 操作培训
Agilent 1100 化学工作站培训日程安排
第一天 上午： 1 2 3 下午：1 欢迎，相互介绍 液相色谱基础 HPLC仪器工作原理 Agilent 1100 硬件的结构及特点 （真空脱气机、泵、自动进样器、检测器） 2 Windows操作系统简介 3 化学工作站的重新安装、配置及启动 4 练习（实验一）
No.26
溶剂传输系统
减小流量脉冲－并联柱塞泵
P 单向阀 B A A B 柱塞A前进
Single Piston Delivery P
Combined Delivery
柱塞B后退
相消干扰 通常也需要阻尼器 增加了单向阀的使用数量
No.27
溶剂传输系统
消除流量脉冲－串联柱塞泵
单向阀
P
Agilent 1100 Series Pumps: Solvent Compressibility Compensation
High MW Compounds Polymers
Size Exclusion
Gel FiltrationAqueous Gel PermeationOrganic
No.8
色谱参数 －定性和定量
tR(B)
tR(A)
Detector Response
t0
Inject A B
W Time
A
W
B
t R = 保留时间 t 0 = 死时间
I0 I
= A = abc
a = 摩尔吸光系数 b = 检测池长度
c = 溶质浓度
No.34
发色团吸收波长
Chromophore
Amine Ethylene Ketone Ester Aldehyde Carboxyl Nitro Phenyl Naphthyl
Structure
- NH 2
max(nm)
Variable Wavelength (UV/Visible)
Slits Light Source Detector Element
flow Cell Mechanical Grating Monochromator
No.36
Instrumentation - Absorbance Detectors
Mobile Phase
Reversed-Phase
C-18, C-8, C-4, C-2
Water/Organic Modifiers
Ionics, Bases, Acids
Ion-Pair
C-18, C-8
Water/Organic Ion-Pair Reagent
Compounds Insoluble in Water, Organic Isomers
W = 峰底宽度
R=2
K’=
tR(B) - tR(A)
WA + WB
= 1.176
tR(B) - tR(A)
W1/2A + W1/2B
tR-t0 t0
No.9
不同R值的峰重叠
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
1.00
1.25