双节线位置 与形状与聚 合物的分子 量有关。 聚合物分子 量越高，相 分离所需浓 度越低； 两种聚合物 分子量相差 越大，双节 线形状越不 对称。
三、物质在两相中的分配

物质在两水相中的分配用分配系数K表示： K=CT/CB
式中： CT、CB—分别代表上下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质 有关，相系统固定时，K为一常数，与溶质的浓 度无关。


在两水相中，水分占很大的比例，生物 大分子（蛋白质、细胞器等）不会引起 失活，但可以不同的比例分配于两相中。
双水相萃取技术定义

利用双水相的成相现象及待分离组分在 两相间分配系数的差异，进行组分分离 及提纯的技术。
第一节 双水相分离理论
一、双水相的形成

两种聚合物溶液相互混合，分层或 混合成一相取决于：


利用生物物质在两相中的不同分配可实现其分离。 生化工程中常用的双水相体系有：
聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）： 聚乙二醇（PEG）/无机盐（硫酸盐或磷酸盐）。 无毒性； 能使生物高分子稳定（多元醇或多糖结构）。

特点：

二、相 图
两水相形 成的条件 和定量关 系常用相 图表示。
P E G 含 量 %
双水相萃取技术

普通溶剂萃取不易用于蛋白质的分离：
许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有 机溶剂； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。

双水相萃取现象
1896年 Bei jerinck 上相：含大部分明胶 明胶＋琼脂 两相 明胶＋可溶性淀粉 下相：含大部分琼脂
（或可溶性淀粉）
双水相的形成
2.2%葡聚糖水 溶液与等体积的 0.72%甲基纤维 素钠水溶液混合 静置
1、表面自由能的影响



平衡时，分子或粒子在溶液中分配，总 是选择两相中相互作用最充分或系统能 量达最低的那个相。 利用不同的表面性质，可达到分离大分 子的目的。 双水相系统适合于生物大分子的分离。
表面自由能的影响


蛋白质在两水相中的分配用K表示： K=C1/C2 分子自相2转移至相1所需的功为E，相平衡 时化学位相等： K=C1/C2=e- E/kT =exp[-A(p1- p2)/kT] =eA/Kt= eM/Kt K主要决定于分子或颗粒的表面积与表面性质 （大分子物质的M值很大， 微小变化， K变 化很大） 。
T
M C B
葡聚糖含量%
a 系线 两相区 b 两相区 系线 双节线 双节线 均相区 均相区
临界点
相 图
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。

成相聚合物的浓度：

接近临界点，蛋白质均匀分配于两相，K接近1； 成相聚合物总浓度增加，系统远离临界点，两相 性质差别增大，蛋白质趋向一侧分配，K或大于1， 或减小低于1。
4、影响分配的参数

盐类的影响：

在两相间形成电位差，对带电生物大分子产生 很大影响。 影响蛋白质中可解离基团的离解度，改变蛋白 质所带电荷和K。 影响相图，影响分配系数。 在聚合物上引入电荷可增大两相间的电位差。
2、表面电荷的影响

荷电粒子在两相中分配不相等时，会于相 间产生电位（道南电位）。
表面电荷的影响

荷电粒子在两相间分配达。平衡时，在两 相中的电化学位应相等。

两相系统中如有盐存在，会对大分子在两 相中的分配产生较大影响
四、影响分配平衡的参数

成相聚合物的相对分子质量：


聚合物相对分子质量降低，蛋白质易分配于富含 该聚合物的相。 在PEG/Dex系统中，PEG分子量下降，分配系数 增大，Dex分子量减小，分配系数降低。

三、 在小分子分离和纯化中的应用



应用于从一些黏度大、难过滤、易乳化 的发酵液中提取小分子。 多采用PEG/盐系统。 在PEG/Dex系统中，小分子分配多呈均 匀分配。
四、亲和分配

亲和分配(亲和萃取)：
亲和层析和两水相萃取相结合。即 一种配基与一种成相聚合物共价结合， 使配基随成相聚合物分配在某一相中， 配基对目标蛋白质有很强的生物亲和力 而使其分配在配基-聚合物的相中。
0.39%葡聚糖 0.65%甲基纤 维素钠 98.96%水
聚合物的不相溶性
1.58%葡聚糖 0.15%甲基纤 维素钠 98.27%水
双水相的形成

聚合物的不相溶性：
聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无 法渗透，当聚合物浓度达到一定值，就 不能形成单一的水相，故具有强烈的相 分离倾向。 某些聚合物溶液与无机盐溶液相混合， 浓度一定，也会形成两相（聚合物-盐双 水相体系）。
亲和分配


用于分离蛋白质，提高了分配系数 和萃取效率； 也用于脱氢酶和激酶等的提取。
五、两水相生物转化反应

两水相转化反应(萃取生物转化)：

反应和分离耦合的过程；

酶促反应：产物转入另一相中，消除产物 抑制，提高产率
两水相生物转化反应条件

反应应满足的条件：
催化剂(酶、细胞等)应单侧分配； 底物应分配于催化剂所处的相中； 产物应分配在另一相中； 要有合适的相比 。


常需根据实验选择最优系统和操作 条件。
两水相生物转化反应

优点：
不需载体，反应速度较快，生产能力 较高； 生物催化剂在系统内较稳定； 两相间表面张力低，易形成高度分散 系统，表面积大，有利于底物和产物 的传递。

体系熵的增加； 分子间作用力。 则分子间作用力占主导地位而决定 混合结果。

聚合物的不相溶性：两种聚合物分子间 如有斥力存在（即某种分子希望在它周 围的分子系同种分子而非异种分子)，达 到平衡后，就有可能分成两相，两种聚 合物分别进入到一相。
常用双水相体系

运用双水相萃取胞内酶应满足下列条件：
欲提取的酶和细胞分配在不同的相中（如细 胞碎片分配在下相—盐，蛋白质分配在上 相—PEG）； 酶的分配系数应足够大，经一次萃取，就能 得到高收率； 两相用离心机易分离；

应用举例

双水相萃取技术可用于多种生物活性物 质的分离纯化。 酶的提取、纯化：

PEG/盐体系 酶上相 菌体下相或界面上 酶的提取率可达90%以上
三步两水相 萃取酶流程
二、工程方面的问题

工业应用上，应考虑萃取达到平衡的 时间和两相分离的设备。
系统中表面张力低，搅拌易分散成微滴， 几秒钟就能达到平衡，且蛋白质失活少， 收率高。 两相分离较难（两相密度差低，处理匀 浆液其黏度大），多用碟片式离心机； 工业上易于放大。

pH值：


温度：


荷电PEG作为成相聚合物：

第二节 双水相萃取技术的应用
一、工艺方面的问题

主要用于胞内酶的提取、精制； 用双水相萃取技术处理细胞匀浆液：

可方便除去细胞碎片，使酶得到精制。

蛋白质在多数情况下收率能达90%； K=2~20，一般大于3，很多杂蛋白质能同 时除去。
双水相萃取运用条件