2、RNase
Py Pu Py Py Py Pu Py Py
2H2O
P P P P
+
P P
P
P
+
P P
（1）牛胰核糖核酸酶（RNase Ⅰ）
作用：嘧啶核苷3’－磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶 产物： 3’嘧啶核苷酸/其结尾的寡核苷酸
（2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）
作用：3’－鸟苷酸与相邻核苷酸5’－OH连键 产物：3’－鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
O R O P OH
pK 0.7 1.6
' 1
O O P OH
N
OH
R
O
-
pK 5.9 6.5
' 2
O O P O
-
R
O
-
H
CH 2 O
H
CH 2 O
N
-
OH pK1' 1.5
OH
-
OH
-
O O P O
O O P O O
Na+激活；Mg2+抑制 ——3’－磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均 长度为6核苷酸。
③链球菌脱氧核糖核苷酸酶：
内切酶，作用于DNA， Mg2+激活 产物为5’－磷酸为末端的碎片，长度不一。
④限制性内切酶(细菌)
主要降解外源DNA 具严格的碱基序列专一性 是基因工程最重要的工具酶。
例如EcoR I ，需Mg离子，不需ATP，专一 性强，能识别DNA链上6个碱基组成的回文 序列，交错切割，形成粘性末端产物。
判断DNA是否变性
G
A
C
U
G
A
G
A
C
U
G
A
2H2O
P P P P P P P P
+
P OH P P P
+
P OH P
（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ）
• 作用位点为Ap残基
• 可将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾 的寡核苷酸
3、DNase
①DNaseⅠ：牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链DNA ——以5’－磷酸为末端的寡聚核苷酸 ② DNase Ⅱ：牛脾脱氧核糖核酸酶
2. 纯DNA或RNA的紫外分光定量
OD260=1.0相当于
• 50μg/ml双链DNA
• 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
有些核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示， 摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。
30.98 A P）＝ （ WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
天然DNA的ε(P）一般为－6600 RNA的ε(P）一般为7700－7800
核酸的ε(P）值较所含核苷酸单体的ε(P）要低40%～45%； 单链多核苷酸的ε(P）值比双螺旋结构多核苷酸ε(P）值要 高。 所以在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大约25%， 此现象称为增色效应。 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
H
N
-
H
O N H O N H
O
N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O O O CH3 NH O
NH
pK1' 9.5 NH
N H O N H O
pK1' 9.9 NH
O N H
CH3
O
N H
腺嘌呤中，质子结合于N1上
NH2
+
NH2 N
NH2 N
' pK 2 9.8
HN
pK1' 4.15 N
H
N
H+ N
N
N
N
NH O
NH
H
O N
N
N
-
HN
pK1' 3.2
H
H2N
HN
' pK 2 9.6
H2N
N
NH
N
NH
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
-
O H+
H2N
N
-
N
H2N
N
NH
N
N
-
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
‥GAATTC ‥ ‥CTTAAG ‥ ‥G ‥CTTAA AATTC‥ G‥
EcoRⅠ命名原则 E：大肠杆菌E.coli属名 co：种名的头两个字母
R：大肠杆菌的菌株
Ⅰ：该细菌中已分离出的这类酶的编号
限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在： 具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。 甲基供体：S－腺苷甲硫氨酸 甲基受体：DNA上的A与C ——甲基化使细菌自身的DNA带上标记, 限制性内切酶专用于降解外来入侵的异种DNA
③按照作用的化学键 磷酸二酯酶（phosphodiesterase）
断3′-OH形成的酯键 断5′-OH形成的酯键 5′-磷酸核苷 3′-磷酸核苷
磷酸单酯酶（phosphomonoesterase）
——切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基
④其它：对底物二级结构的专一性 双链酶：作用于双链核酸 单链酶：作用于单链核酸
（二）碱水解
RNA磷酸酯键被水解——生成2’/3’ -核苷酸
DNA则不受影响
∵脱氧核糖无2’－OH， ∴不能形成碱水解中间产物
DNA在1mol/LNaOH中加热至100℃4h，可得 到小分子的寡聚脱氧核苷酸。
（三）酶水解——磷酸二酯键
1、酶分类
①根据底物分为： DNase、RNase ②根据作用方式： •核酸外切酶 从一端（3′/5′）逐个水解 •核酸内切酶 从中间开始在某个位点切断
4、N－糖苷酶
水解糖苷键
非特异性的糖苷酶
碱基特异N－糖苷酶
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 ______主要是环内氨基的贡献
二
胞嘧啶中
NH2
+
NH2
NH2
' pK 2 12.5
HN
pK1' 4.6 N
一、核酸的水解
酸、碱、酶水解
• 作用于磷酸二酯键和糖苷键 • DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别
（一）酸水解
糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解； 嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定； 对酸最不稳定的：嘌呤与脱氧核糖间糖苷键
DNA: pH2.8、100℃加热1h，或pH1.6，37 ℃对水透析 可除去嘌呤碱 形成无嘌呤酸（apurinic acid，APA）
H

CH 2 O
N
CH 2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
可用紫外分光光度计 加以定量和定性。
• OD260的应用： 1.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低