酸基
核
苷
酸离
的
子 化
解
程 度
离
曲
线
鸟嘌呤核苷酸
pK2 = 3.7
含氮环 pK3 = 6.1
pK1 = 0.7
第二磷酸基
第一磷酸基
烯醇式羟基
pK2 = 4.3 含氮环
胞嘧啶核苷酸
pK1 = 0.8 第一磷酸基
pK3 = 6.3 第二磷酸基
pK1 = 1.0 第一磷酸基
尿嘧啶核苷酸
pK3 = 6.4 第二磷酸基
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影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性 。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA 的均一性 。 ②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44
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③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。
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利用酸水解可以研究核酸的碱基组成
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（二）碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感
室温，0.3～1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解， 得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA抗碱水解 生理意义：
DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
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或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）
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四、核酸的变性、复性及杂交
(一)变性
核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 不涉及共价键断裂。
（三）酶水解
非特异的磷酸二酯酶：
蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸
特异的磷酸二酯酶： 核酸酶
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1、核酸酶的分类
★底物专一性：
核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase
★作用方式：
核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶 (endonuclease) 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶
★RNase T1
耐热、耐酸 产物：3′-鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高
★RNase T2
产物：将tRNA完全水解为以3′-腺苷酸结尾的寡核苷酸
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3、DNase
★核酸酶S1 作用于单链DNA部分 ★牛胰脱氧核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA，产物：以5′-磷酸为末端的寡 核苷酸 ★牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase Ⅱ 产物：以3′-磷酸为末端的寡核苷酸 ★DNA限制性内切酶
第十四章 核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性及杂交
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一、核酸的水解
（一）酸水解
对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键
嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 脱嘌呤：
pH1.6，37℃，对水透析 pH2.8，100℃，1h
脱嘧啶：
98-100%甲酸，175℃，2h 三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或 80min（RNA）
烯醇式羟基
pH
小牛胸腺DNA 的滴定曲线
pH
三、核酸的紫外吸收
碱基、核苷、核苷酸和核酸在240～290nm的紫外 波段有强烈的光吸收， λmax=260nm
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1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降 低。 2、含量计算 1ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA
★磷酸二酯键的断裂方式：
5′-（寡）核苷酸 3′-（寡）核苷酸
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2、RNAase
★RNase H
作用于DNA-RNA中的RNA链
★牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I
最适pH ：7.0-8.2 产物：3′-嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一的 内切酶
(二)复性
变性DNA在适当（一般低于 Tm20 ～ 25℃ ） 条 件 下 ， 两 条链重新缔合成双螺旋结构。
★复性机制：10～20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复 性，快速冷却不能复性。
★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。
★复性速度可用Co·t衡量。 Co 为 变 性 DNA 原 始 浓 度 mol·L-1 ， t为时间，以秒表示。
20●20/根9/22据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷 贝数
波长（nm）
★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很 窄的温度范围内。
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链 温度（Tm）。
浓 度 50ug/mL 时 ， 双 链 DNA A260=1.00，完全 变 性 （ 单 链 ） ， A260= 1.37。当A260增加到最大 增大值一半时，即1.185 时，对应的温度即为Tm。 DNA 的 Tm 一 般 在 82 ～ 95℃之间。
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●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。
4、N-糖苷酶
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二、 核酸的酸碱性质
磷酸和碱基均能发生两性解离。 DNA等电点 4～4.5 RNA等电点 2～2.5 1、碱基的解离 P504 2、核苷的解离 P505 3、核苷酸的解离
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pK2 = 3.7
腺嘌呤核苷酸
含氮环 pK3 = 6.2
pK1 = 0.9
第二磷酸基
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★变性因素：
热变性
酸碱变性（pH小于4或
大于11）
0.4
变性剂（尿素、盐酸胍、
甲醛）
0.3
光
吸
★变性后的理化性质： 260nm吸收值升高。
收
0.2
粘度降低，浮力密度升 0.1 高。
二级结构改变，部分失
活。
220
1 天然DNA 2 变性DNA 3 核苷酸总吸收值
3 2 1
240 260 280