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顶空气相色谱_质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸_江振作

江振作1,2,3
2
王跃飞 * 1,2
1
陈荣荣1,2
朱 彦1,2
3
张 蕾1,2
刘 双1,2
刘海利3
( 天津市现代中药重点实验室, 天津中医药大学, 天津 300193 ) ( 瀚盟生物技术( 天津) 有限公司, 天津 300457 )
( 中药新药研发中心, 天津国际生物医药联合研究院, 天津 300457 ) 摘 要
2013 11 07 收稿; 2013 12 02 接受 国家自然科学基金( No. 81202877 ) 、 天津市滨海新区专业性科技服务业项 本文系重大新药创制科技重大专项( No. 2012ZX09304007 ) 、 目( No. 2012 XJR13006 ) 资助 * Email: wangyuefei_2006@
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分析化学
第 42 卷
~ 性强、 无紫外吸收和荧光基团, 故多采用 GC 法分析。目前, 挥发性脂肪酸多需进行衍生化处理 [12 14] , 或 [15,16] 经过液液萃取法 处理后再进行 GC 分析, 存在操作繁琐、 萃取效率低、 操作时间长、 提取歧视效应、
重复性较差、 试剂毒性较大等不足。 因此, 需要建立一种简单、 快速检测粪便中挥发性脂肪酸的方法。 本研究建立了一种快速分析粪便中挥发性脂肪酸 ( Volatile fatty acids, VFAs ) 的顶空气相色谱质谱联用 GC/MS) 。 粪便样品用 6% H3 PO4 溶液混悬后即 法( Headspace gas chromatography mass spectrometry, HS可分析, 无需进行复杂的前处理。 而 Gao 等 [12] 对粪便水溶液进行氯甲酸乙酯化处理后进行 GCMS 分 析, 采用两步衍生化向粪便水溶液中依次加入 L2 氯苯丙氨酸、 乙醇吡啶 ( 6∶ 1 ,V/V) 、 氯甲酸乙酯, 超 用 NaOH 溶液调节上清液至 pH 9 ~ 10 , 再加入氯甲酸乙酯混合超 声 1 min 后加入正己烷萃取并离心, ( 甲硫基) 丙酸乙酯的正己烷终止反应, 声, 加入含 3 再进行分析; 又如贾益群等 [15] 在酸性条件下用乙醚 萃取粪便水溶液中, 首先用纯水溶解粪便, 离心过膜后, 取适量粪便水溶液加入 H2 SO4 溶液后再加入乙 醚, 振荡 30 次后离心 5 min, 置 4 ℃ 冰箱 30 min, 取上层乙醚溶液进行 GC 分析。 本方法与衍生化法或 液液萃取法相比, 操作简单、 处理时间短, 能最大限度的保留粪便中的挥发性成分, 不存在衍生化或提 减少处理过程中挥发性成分的损失 , 所用试剂安全易得, 可用于人和大鼠粪便中挥发性 取的歧视效应, 。 脂肪酸的快速测定
2.2
标准溶液配制
准确称取适量上述 7 个对照品于 10 mL 容量瓶中, 以 6% H3 PO4 溶液定容, 制成每 1 mL 含乙酸 、 、 、 、 、 、 5.02 mg 丙酸 2.58 mg 异丁酸 4.53 mg 丁酸 4.72 mg 异戊酸 4.25 mg 己酸 4.25 mg 庚酸 5.97 mg 的混合 对照品溶液。 H3 PO4 溶液的配制: 精密移取 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 和 1.0 mL H3 PO4 , 分别置于 10 mL 容量瓶中, 用超纯水 定容, 超声混匀, 得到 2% , 4% , 6% , 8% , 10% H3 PO4 溶液。 2.3 样品处理方法 收集人和 SD 大鼠的新鲜粪便置于具塞广口瓶中 , 于!80 ℃ 冰箱保存备用。本研究采用的大鼠粪便 经动物中心负责人审批后收集; 研究用人粪便的收集经自愿者同意并签署了知情同意书 。 HSGC/MS 分析: 取!80 ℃ 冻存的人或 SD 大鼠粪便, 用研钵立即研碎并混匀, 精密称取 2.0 g, 置于 20 mL 顶空进样瓶中, 加入 6% H3 PO4 溶液 4 mL, 密封, 超声 1 min, 置于顶空进样器中。 粪便缓冲能力的测定: 精密称取 6 份研碎的大鼠粪便 0.5 g, 分别加入不同浓度的 H3 PO4 溶液1 mL, 超声 1 min 使混匀, 立即用精密 pH 试纸检测。 2.4 HSGC/MS 条件 2.4.1 2.4.2 顶空进样条件 顶空振荡室加热温度: 80 ℃ ; 加热时间: 30 min; 加热方式: 震荡加热; 1.0 mL 顶空 进样针温度: 80 ℃ ; 进样量: 1 mL, 不分流模式; 用高纯氩气推动和清洗顶空针; 清洗时间: 0.5 min。
第 42 卷 2014 年 3 月
分析化学 ( FENXI HUAXUE)
研究报告
第3 期 429 ~ 435
DOI: 10.3724/SP.J.1096.2014.31077
Chinese Journal of Analytical Chemistry
顶空气相色谱 质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸
3
3.1
结果与讨论
样品处理方法优化
3.1.1 稀释液的选择 挥发性脂肪酸的极性较大、 在水中易发生电离, 在水溶液中以 HA ( 游离型 ) 和 ! A ( 离子型) 两种形式存在, 两者存在的量可以用分布系数 ( δ ) 表示, 由解离常数 Ka ( 或其负对数值 pKa ) 和溶液的 pH 决定。当用水作为稀释液时, 由于水的 pH ( ~ 6.5 ) 大于挥发性脂肪酸的 pKa 值 ( 如甲 酸 pKa = 3.74 ) , 因此挥发性脂肪酸主要以 A ! 形式存在; 若直接用 HSGC/MS 检测, 由于 A ! 不易气化, 导致测定结果偏低, 甚至无法被检出; 当改用酸作为稀释液时, 由于溶液的 pH 值较低, 挥发性脂肪酸主 要以 HA 形式存在, 可以采用 HSGC/MS 进行准确分析。 考虑稀释液所用酸的挥发性及酸度对样品的 , ( 影响 故采用非挥发性中强酸 H3 PO4 ) 作为酸性调节剂。 图 1 为加 H3 PO4 前后样品的总离子流图。 由 图 1 可知, 样品用 H3 PO4 稀释液处理后, 各挥发性脂肪酸的响应均明显提高 。
建立了一种快速分析粪便中挥发性脂肪酸( Volatile fatty acids, VFAs ) 的顶空气相色谱质谱联用法
( Headspace gas chromatographymass spectrometry, HSGC/MS) 。粪便样品用 6% H3 PO4 溶液按 1∶ 2 ( m/V) 混悬 后密封于顶空进样瓶中, 直接进行 HSGC/MS 检测。顶空振荡室加热温度为 80 ℃ , 振荡加热时间 30 min, 顶 不分流进样 1 mL; 采用 DBFFAP 毛细管柱( 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) , 进样口温度 空进样针温度为 80 ℃ , 为 250 ℃ , 升温程序( 初始温度 50 ℃ 保持 1 min, 以 10 ℃ /min 升至 200 ℃ ) , 载气( 高纯氦) 流速为1.0 mL/min; 使用电子轰击( Electron impact, EI) 离子源, 电子能量为!70 eV, 离子源温度为 250 ℃ , 传输线温度为280 ℃ , 电 全扫描模式, 扫描范围 m/z 33 ~ 200 。结果表明, 本方法能够应用于人及大鼠粪便中 子倍增器电压为 0.95 kV, 挥发性脂肪酸的分析, 通过 NIST 标准谱库检索, 采用对照品比对以及质谱数据解析的方法, 在人的粪便样品 中检测到 9 种挥发性脂肪酸: 乙酸、 丙酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸、 异己酸、 己酸、 庚酸; 在大鼠粪便中检测 丙酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸、 己酸、 庚酸。通过峰面积归一化法, 计算得到乙 到 8 种挥发性脂肪酸: 乙酸、 丙酸、 丁酸的相对百分含量约占挥发性脂肪酸总量的 85% 。本方法简单、 灵敏, 可用于人和大鼠粪便中挥 酸、 发性脂肪酸的快速检测 。 关键词 顶空气相色谱质谱联用法; 粪便; 肠道菌群; 挥发性脂肪酸
GC 条件 DBFFAP 色谱柱( 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) ; 升温程序: 初始温度 50 ℃ 保持 1 min, 以 10 ℃ /min 升至 200 ℃ ; 进样口温度: 250 ℃ ; 载气: 高纯氦( He) , 纯度 > 99.999% ; 流速: 1.0 mL/min。 2.4.3 MS 条件 电离方式: EI; 电子能量: !70 eV; 离子源温度: 250 ℃ ; 传输线温度: 280 ℃ ; 电子倍 增器电压: 0.95 kV; 全扫描模式,扫描范围 m/z 33 ~ 200 。
[17 ~ 19] [12 ~ 16]
、 高效液相色
、 毛细管电泳法 ( Capillaryelectrophoresis, CE) [20] 谱法( High performance liquid chromatography, HPLC) 和原子吸收分光光度法( Atomic absorption spectrophotography, AAS) [21] 。由于挥发性脂肪酸极性大、 挥发
第3 期
江振作等: 顶空气相色谱质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸
431
2.5

数据处理
样品中未知挥发性成分的定性分析 : 通过计算机检索 NIST 标准质谱库得到化合物信息, 统计 R 和 F 匹配度( 其中, R 匹配: 样品谱图与标准谱库检索得到结果的相似度; F 匹配: 标准谱库逆向检索得到 结果与样品谱图的相似度, 两者最大值均为 1000 ) 均大于 700 的挥发性成分。
2
2.1
实验部分
仪器、 材料与试剂 GC450 MS320 型气相色谱质谱联用仪( 美国 Varian 公司) , 配有 CombiPAL 顶空进样器, Varian MS Workstation 6.92 工作站; DBFFAP 毛细管柱( 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, 美国 Agilent 公司) ; MilliQ超 纯水系统( 美国 Millipore 公司) ; AL 204 万分之一天平( 瑞士 METTLER TOLEDO 公司) ; SCIENTZ 25 12 超声仪( 宁波新芝生物科技股份有限公司 ) ; pH 0.5 ~ 5.0 和 pH 5.5 ~ 9.0 精密试纸 ( 天津市塘沽区鹏达化 工厂) 。 乙酸、 丙 酸、 异 丁 酸、 丁 酸、 异 戊 酸、 己 酸、 庚 酸 对 照 品 ( 纯 度 ≥ 99% , 美 国 Sigma 公 司 ) ; H3 PO4 ( > 85% ,天津市光复精密化工研究所) 。
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