转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测近年主要转基因粮食作物大豆、玉米和水稻加工产品已应用于食品制造业，为此，食品中转基因成分的安全性受到广泛关注。
当前，国际贸易和各国食品工业等部门对转基因产品逐步实施IP(Identity Preservation)管理，加强检测监控。
深加工品经过若干道加工程序，理化性质变化、DNA断裂，转基因成分检测的难度大大增加。
目前，国际上没有统一的针对转基因粮食作物深加工产品的检测标准，而我国也没有建立有效的检测标准对市场上常见的转基因大豆、玉米和水稻深加工产品中的主要外源CrylA (B)、BAR、CP4 EPSPS和PAT基因进行检测。
五重巢式PCR是近几年出现的检测技术，它结合了巢式PCR的高灵敏度和多重PCR的快速、简单和高特异性特点，可以减少假阳性，可以同时检测多个基因片段，可以使检测灵敏度的下限提高几千倍…3]。
五重巢式PCR方法快速、灵敏度高，在人和动物疾病检测和病毒鉴定中应用较多。
目前该技术在转基因检测中的应用还较少，仅在转基因大豆深加工制品和转基因水稻种子的检测中有半巢式PCR应用的报道。
但这些技术仅能对转基因大豆或水稻单一品种进行检测，在做不同品种或品系转基因成分检测时，需要分别试验，比较繁琐。
迄今为止，还没有快速、高通量同时检测不同品种和不同品系的转基因大豆、玉米和水稻外源基因的报道。
本研究旨在建立五重巢式PCR体系，探索粮食深加工产品中的转基因成分，实现不同品种和不同品系粮食作物转基因成分的高通量检测，为转基因深加工产品检测标准的建立提供理论基础。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 试验材料转基因RR大豆购自美国孟山都公司；转基因玉米Bt11、Bt176由吉林农科院惠赠；转基因水稻由农业部转基因生物安全管理办公室提供；转基因玉米MON810、TC1507、T25和CBH-351购自香港基因芯片公司，作为阳性对照。
非转基因大豆、玉米和水稻由东北农业大学农学院提供，作为阴性对照。
待检深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片（含有稻米成分）和玉米泥均购自超市，均未注明是否含有转基因成分。
1.1.2试验试剂Wizard@试剂盒，Promega公司(Madison，USA)；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液（含MgC12）、DL DNA2000分子质量标准，大连宝生物工程有限公司；特异引物，上海英俊生物公司。
1.1.3仪器设备高速离心机（上海安亭公司，TDL-40B型）、PCR仪（德国Biometra，Biometra Tgradient 型）、核酸电泳仪（杭州托普仪器有限公司，GE-100型）、紫外分光光度仪（美国BECKMAN，DU@ 640型）、凝胶成像系统（美国UVP，G8000型）。
1.2方法1.2.1 DNA提取将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合成标准品，取标准品和待测样品（按操作说明要求的质量）分别根据Wizard@试剂盒操作说明进行DNA提取，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50 ng/uL)。
1.2.2 引物设计利用Primer Premier V5.0软件进行五重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小见表1。
1.2.3 五重巢式PCR反应体系1)第1轮五重PCR反应体系及反应条件。
在第1轮五重PCR反应体系中，加DNA模板1uL(50 ng)，dNTP各0.4 mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液工（CP4 WF/ CP4 WR，0.8umol/L;Rbcl WF/Rbcl WR,0.3 umol/L;CryWF/Cry WR,0.25 umol/L;BAR WF/BAR WR,0.4umol/L; Pat WF/Pat WR，0.4 ptmol/L;)10 uL，DNA聚合酶4 U，补去离子水至50 uL。
扩增条件为：95℃预变性10 min; 95℃30 s，65℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，62℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，60℃60 s，72℃60 s，10个循环；95℃30 s，58℃60 s，72℃60 s，10个循环：72℃，10 min。
2)第2轮五重PCR反应体系及反应条件。
取第1轮五重PCR产物1_uL作为模板，进行五重巢式PCR第2轮扩增。
反应体系中加引物混合液Ⅱ(CP4 NF/ CP4 NR,0.6umol/L; Rbcl NF/Rbcl NR,0. 25 umol/L; CryNF/Cry NR,0.5umol/L; BAR NF/BAR NR,0.3 umol/L;Pat NF/Pat NR,0.6umol/L;)10 uL，DNA聚合酶4U，其余步骤同前。
扩增条件同上。
3)检测方法的灵敏度分析。
将转基因大豆、玉米、水稻和非转基因大豆、玉米、水稻分别按不同质量比混合，使样品转基因成分的含量分别达到5%、1%、5×10-1%、5×10_2%、5×10_3%、10-3%、5×10_4%和10-4%。
用上述PCR方法对含混合DNA样品进行灵敏度测试。
4)扩增产物检测。
两轮多重PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测，琼脂糖胶质量分数为3%，胶中溴化乙锭质量浓度为0.5ug/mL，电泳缓冲液为1× TAE，以DL-2000 DNA做分子质量标准，电泳条件为10 V/cm电压，电泳lh。
2 结果与分析2.1 DNA提取本研究所选材料均是深加工制品，测量所提取DNA样品的OD260值小于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带（图1），说明所提取DNA样品浓度很低。
用普通PCR扩增是检测不出结果的，但用随后的五重巢式PCR进行扩增却可以检测到清楚的目的带，说明使用Wizard@试剂盒提取的DNA可以满足五重巢式PCR扩增的需要。
2.2 五重巢式PCR样品检测第1轮扩增结果见图2(a)，该体系扩增出阳性对照的CP4-EPSPS基因、RBCL基因、CrylA (B)基因、BAR基因和PAT基因，扩增片段大小分别为498、433、321、201和160 bp及阴性对照的RBCL 基因。
阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除转基因成分污染的可能；空白对照无扩增条带说明无污染。
但其他泳道未看到扩增结果，表明深加工制品中DNA含量非常低，普通的PCR反应无法进行转基因检测。
第2轮扩增结果(图2(b))显示，卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出RBCL基因和CP4-EPSPS基因片段，即以上4种样品含有转CP4-EPSPS基因成分；玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、CrylA (B)基因和PAT基因片段，即以上2种样品含有转CrylA (B)基因和PAT基因成分；玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、CrylA(B)基因和BAR基因片段，即含有转CrSA (B)基因和BAR 基因成分；营养麦片扩增出RBCL基因和CrylA (B)基因片段，即含有转CrylA (B)基因成分；大豆精炼油大豆色拉油和玉米油未检出任何条带，即未从这3种样品中提取出DNA。
表明经过第2轮的巢式PCR扩增，可以检测出除精炼油外的深加工制品的转基因成分。
2.3 五重巢式PCR灵敏度分析在第1轮五重PCR灵敏度分析实验中，5× lO_1%的阳性混合标准品中利用5对外引物能够同时扩增出5个目的基因片段，在5×10-2G的阳性t昆合标准品中只能扩增出RBCL基因、CrylA (B)和PAT基因，说明第1轮五重PCR的灵敏度为0.5%（图3）。
在第2轮五重PCR灵敏度分析实验中，5×10-3%的阳样性混合标准品中能够同时扩增出较为清晰的5个目的基因，1×10-3%的阳性混合标准品中只能扩增出RBCL基因、CP4-EPSPS基因和CrylA (B)基因，5×10_ 40的阳性混合标准品中只能扩增出RBCL基因和CrylA (B)基因，说明五重巢式PCR的灵敏度为5×10_3%（图4）。
3 结论与讨论1)本试验针对转基因市场上常见的转基因粮食作物大豆、玉米和水稻的主要外源CrylA (B)基因、BAR基因、CP4EPSPS基因、PAT基因及共同的内标准基因RBCL基因的特点设计了10对引物，建立了五重巢式PCR体系，其检测灵敏度达到0.005%，对11个大豆、玉米和水稻深加工制品进行了五重巢式PCR检测，检测出除大豆精炼油、色拉油和玉米油以外的所有深加工产品的主要外源CrylA(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的内标准基因RBCL基因，结果表明本研究建立的五重巢式PCR检测方法适用于主要转基因粮食作物深加工产品的定性检测。
深加工转基因产品中DNA提取需要大量的样品材料才能得到足够的DNA进行分析。
由于深加工食品中DNA模板含量少，需要利用高效的或特殊的DNA提取方法，以提取到其中微量的DNA。
使用普通的DNA和其他试剂盒进行DNA提取，不能扩增得到PCR产物，说明DNA提取失败。
利用Wizard@试剂盒，可有效提取到所选11种样品中8种样品的DNA模板。
实验表明，豆油和玉米油中的DNA在产品制备过程中已遭到极为严重的破坏和降解并且含量极低，对豆油和玉米油已无转基因检测的必要，而其他深加工产品均可使用此试剂盒进行DNA模板提取。
外源基因在转入植物中时，作了不同程度的修饰和改造，导致不同品种、品系的转基因植物中相同基因的DNA序列有很大差异。
如CrylA (B)基因在抗虫水稻和抗虫玉米中就不相同，并且在玉米的不同品系如BTll、BT176和MON810中也不相同，这样就给检测这些基因造成了很大麻烦，对于不同品种甚至不同品系转基因植物的检测都需要设计不同的引物进行PCR扩增。
本试验对同一目的基因在不同品种和不同品系中的序列进行分析，在保守区域设计多对引物，筛选出了可以在不同品种和不同品系中通用的引物进行检测，所设计的CrylA(B)基因引物可以同时扩增转基因玉米BT11、BT176、MON810和转基因水稻中的CrylA(B)基因；PAT基因引物可以同时扩增转基因玉米BT11、T25和TC1507中的PAT基因；BAR基因引物可以同时扩增转基因玉米BT176和CBH351中的BAR基因，大大提高了检测效率。