拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应赵彦敏;高海琴;瓮巧云【摘要】采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA 插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长.结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势.在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0.当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异.可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl 胁迫能力的作用.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P7-10)【关键词】ABI3基因;T-DNA插入;突变体;NaCl胁迫【作者】赵彦敏;高海琴;瓮巧云【作者单位】张家口广播电视大学,张家口075000;张家口广播电视大学,张家口075000;河北北方学院农林科技学院,张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2植物在生长发育过程中,不可避免地会受到各种非生物因素如干旱、低温、高盐及高温等的胁迫,导致农作物的生长品质及产量下降。
作为植物体内重要的逆境响应激素之一,脱落酸(Abscisic acid,ABA)既是胁迫的诱导产物,又是胁迫信号的传导者,通过级联放大反应,能迅速参与到植物抗胁迫的反应中。
此外,脱落酸还参与植物生长的其他环节,如能促使马铃薯形成块茎、抑制种子的萌发等。
早期通过正向遗传学方法筛选到一些在萌发率上对 ABA不敏感的拟南芥基因,如 ABI1-1、ABI2-1、ABI3、ABI4和ABI5[1-4];作为ABA信号的正调控转录因子ABI3基因,在植物的抗旱性和耐盐性功能中起重要的作用[5],主要在种子里表达[2]。
尽管在玉米、拟南芥、水稻等多种植物中已经发现了ABI3基因的存在,但ABI3在ABA介导的信号通路中的作用并不清楚。
为了研究ABI3基因在拟南芥抗NaCl胁迫中的作用,本试验检测野生型拟南芥和ABI3基因突变体在NaCl胁迫下种子萌发率、籽苗根长及其生物量的差异,以期为研究拟南芥ABI3基因的功能提供参考。
1 材料与方法1.1 材料拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0和ABI3基因T-DNA插入突变体abi3种子购买于美国拟南芥种质资源中心(The Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC),MS培养基干粉购于北京石木易生公司,植物DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒等购于天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 拟南芥的培养分别取拟南芥野生型(Col-0)及ABI3基因突变体(abi3)种子,在10%NaClO3中消毒5 min后,用灭菌的去离子水冲洗2遍,播种于固体MS培养基上。
在4℃下春化3 d,转移至光照培养箱再培养7 d,分别将野生型Col-0和abi3突变体的籽苗移植于蛭石与石英砂混匀(1∶1)的花盆中,于光照培养箱中继续培养2周。
光照培养箱的培养条件为22℃、相对湿度60%、光周期8 h光照∕16 h黑暗、光照强度3 000 lx。
1.3 纯合突变体abi3的筛选和鉴定收集上述种植的拟南芥叶片,利用植物基因组DNA提取试剂盒提取拟南芥基因组DNA。
以基因组DNA为模板,利用三引物法筛选和鉴定abi3纯合突变体。
根据http：∕∕∕网站上提供的TDNA 插入位点信息,设计鉴定引物。
引物分别为 LBb1.3：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’、LP：5’-TCGGTCCATGGTAGGTAACTG-3’和 RP：5’-GAGAAGATCCGACTCCAAACC-3’。
LP∕RP 和LBb1.3∕RP 的PCR产物预期大小分别为1 220 bp和559—859 bp。
25 μL PCR反应体系包括：1 μL DNA模板、上述3个引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,用ddH2O补足至25 μL。
扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性40 s、60℃退火2 min、72℃延伸1 min,循环35次;最后72℃延伸10 min。
1.4 野生型Col-0和abi3突变体植株ABI3基因表达量测定分别取上述拟南芥的叶片提取总RNA,并反转录为cDNA。
以cDNA为模板,以拟南芥β-actin为内参基因,检测ABI3基因的表达情况。
基因特异性正反引物分别为5’-TGAATCCGTACCAATATCCTTATG-3’和5’-TCTCGCCATCCGTTTCTTTC-3’;内参基因β-actin的特异性引物为5’-CTCCCGCTATGTATG TCGCC-3’和5’-CAGCAAGGTCAAGACGGAGG-3’。
PCR 反应体系：2 × dNTP mix 25 μL,正反引物(25 pmol∕μL)各1 μL,模板cDNA 2 μL,补水至50 μL。
扩增程序为：94℃ 预变性4 min;94℃变性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环35次;最后72℃延伸10 min。
扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.5 NaCl胁迫对拟南芥植株的影响拟南芥野生型Col-0和abi3突变体种子经表面消毒后,分别播种于含有不同浓度NaCl(0 mmol∕L、100 mmol∕L、125 mmol∕L、150 mmol∕L)的 MS 培养基上。
观察种子萌发情况,并于第 7 天统计各处理的萌芽率(以种子露白为准),于第9天测定各处理的生物量(30株∕处理)。
为了检测NaCl胁迫对突变体根长的影响,种子消毒后点种于培养皿进行垂直培养,培养8 d后进行根长的测量。
2 结果与分析2.1 突变体鉴定根据http：∕∕∕网站所提供的信息,可知T-DNA插入到该基因的第1个内含子内(图1-A),由于T-DNA的片段较长,引物LP∕RP不能将其所包含的DNA 序列扩增出来。
如果是突变纯合子,只能借助T-DNA上的引物与基因上的引物LBb1.3∕RP才能扩出条带,条带大小约为500 bp;如果是突变杂合子,利用LBb1.3∕RP和LP∕RP两对引物在DNA水平上可扩增出2个条带,分别约为500 bp 和1 000 bp。
由图1-B可知,所检测的突变体均为纯合突变体。
对初步鉴定出的纯合突变体进行RT-PCR,如图1-C所显示,拟南芥野生型Col-0扩增出一条带,约500 bp,7株突变体中只有第5株没有扩增产物。
由此可见,所检测的7株突变体中只有1株中的ABI3基因因为T-DNA的插入而完全沉默。
收集该植株的种子,用于后续ABI3基因功能的研究。
图1 拟南芥abi3突变体的鉴定和基因表达分析Fig.1 Identification and gene expression analysis of Arabidopsis thaliana mutant abi3由图2可知,在无胁迫条件下,野生型Col-0及abi3突变体植株表型差异不明显。
2.2 NaCl胁迫对abi3突变体的影响2.2.1 NaCl胁迫对突变体种子萌发率的影响由图3可知,在不含NaCl的培养基上,拟南芥野生型Col-0和abi3突变体种子的萌发率并无显著差异,且长势基本一致;随着NaCl浓度的升高,abi3突变体种子的萌发率明显受到抑制,当NaCl浓度达到150 mmol∕L时,abi3突变体种子的萌发率仅为44%,与野生型Col-0种子的萌发率存在极显著差异。
图2 野生型Col-0(左)和abi3突变体(右)的表型Fig.2 Phenotypes of wild type Col-0(left)and abi3 mutant(right)图3 不同浓度NaCl胁迫下拟南芥种子的萌发率Fig.3 Germination rate of Arabidopsis thaliana seeds under NaCl stress of different concentrations 2.2.2 NaCl胁迫对突变体生物量的影响图4 不同浓度NaCl胁迫下拟南芥的生物量Fig.4 Biomass of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations如图4所示,在不含NaCl的培养基上,拟南芥野生型Col-0的生物量高于abi3突变体,但二者之间的差异并不显著;随着NaCl浓度的升高,野生型Col-0与abi3突变体的生物量均明显下降,但突变体下降的幅度更为显著,当NaCl浓度达到125 mmol∕L和150 mmol∕L时,abi3突变体与野生型Col-0的生物量之间存在极显著差异。
2.2.3 NaCl胁迫对突变体根长的影响如图5所示,野生型Col-0与abi3突变体的根长在不含NaCl的培养基上尽管有所不同,但二者之间的差异并不显著;随着NaCl浓度的升高,野生型Col-0与abi3突变体根长的生长均受到了抑制,突变体受抑制的程度更为显著,当NaCl浓度达到125 mmol∕L和150 mmol∕L时,野生型Col-0与abi3突变体的根长之间存在极显著差异。
图5 不同浓度NaCl胁迫下拟南芥植株的根长Fig.5 Root length of Arabidopsis thaliana plants under NaCl stress of different concentrations3 讨论ABA是保卫细胞信号转导的关键信号因子,不仅参与生物胁迫,而且在低温、干旱、高盐等非生物胁迫条件下也起着重要作用。
普遍认为ABA通过促进开放的气孔关闭或抑制关闭的气孔开放,控制植物与外界进行水分与气体的交换,从而调节植物的代谢与生理活动[6]。
如给番茄喷施外源ABA时,miR159的表达量会下调,从而上调其对应的靶基因MYB[7],而MYB基因的上调对提高植物抗逆境能力有促进作用[8]。
种子休眠的建立和维持与ABA有着密切的相关性,ABA的累积可诱导野生型拟南芥种子进入休眠,并维持休眠状态,而ABA不敏感突变体(abi1和abi2)种子表现为轻度休眠[9-10]。
本研究中,当野生型Col-0与abi3突变体受到150mmol∕LNaCl胁迫时,abi3突变体种子的萌发率、籽苗的生物量以及根长的受抑制程度显著高于野生型Col-0,初步表明ABI3基因在拟南芥抗NaCl胁迫中起着极其重要的作用。