液相酶免疫测定
游离的和结合的酶标记都存在于液相中，需用分离剂 分开后测结合状态的酶标记物的活性。
固相酶免疫测定
通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上， 只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。以ELISA最常用。
酶联免疫吸附测定
(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)
常用的酶及显色底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 （HRP）
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺 （TMB）
对硝基苯磷酸酯 （p-NPP）
加终止液前 颜色
橙黄色
蓝色
黄色
加终止液后 颜色
橙黄色
黄色
黄色
酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分）
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定（EMIT、CEDIA）
ELISA过程
1、包被 抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被。 2、复合物的形成 加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原), 生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体 的复合物。
3、酶与该酶底物反应 抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体复合 物与该酶的底物反应生成有色产物。 4、检测 借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。 待测抗体(抗原)的定量与有色产物成正比。
酶免疫增强测定技术（EMIT）
酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶 与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记 抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多， 竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的 活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的 抗原含量呈正相关。
ELISA的试剂
三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原（抗原）或抗体，即
“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”
（conjugate）； （3）酶反应的底物。
完整的剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参 考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液；
标本中抗原
+
抗体
ED
ED标记抗原
ED
+
EA
X
ED EA
活性酶
异相酶免疫测定
抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶 标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标 记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。故需将游 离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标记物的 活性推算待测物的含量。由于分离方法不同，又分为
（6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
1免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃） 干燥的条件下一般可保存6个月。 1.1 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。 ELISA载体的形状主要有三种：微 量滴定板、小珠和小试管。国际上标准的微量滴定 板为8×12的96孔式。
1.5 包被的条件 抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液 作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7-8 的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。 通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中 放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包 被效果。 一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。 为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底 过高，常用1%--5%BSA封闭空隙。
2 结合物
酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。 良好的结合物应具备： 既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的 免疫活性。 结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比 例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有未结合的 酶或抗体（或抗原）。 结合物要有良好的稳定性。
是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,
可用于测定抗原，也可用于测定抗体 。
ELISA的原理
将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原 抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体 上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后 ，加入底物显色，定性或定量分析有色产物从 而确定待测物的存在与含量。
1.2 包被的方式 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结 多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗 体的包被一般均采用直接吸附法。 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。 可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原 的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使 抗原固相化。
酶免疫技术 EIA
拟探讨的问题
酶免疫技术的定义 酶免疫技术的类型 ELISA的原理 ELISA的类型 ELISA的试剂（三个必要试剂） ELISA的过程
ELISA的操作要点 酶免疫技术的发展
概念
以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应 的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的 一种免疫检测技术。
酶
抗体
酶
抗体
底物
酶 标记抗原
半抗原 （未标记）
克隆酶供体免疫分析（CEDIA）
酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结 合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗 原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体 （EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性 受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性 与未标记抗原的含量呈正相关。
DNA抗原的包被 紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时）
固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋 白等作预包被，也可提高核酸的结合力。
用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA
脂类物质的包被
可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待 酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
酶免疫测定
液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 （如ELISA）
均相酶免疫测定
利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就 受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物， 直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合 的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗 原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。