包被
• 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之， 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 • 抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相 载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固 相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是 非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。
的颜色反应。
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
显色反
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶 标板）；
（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；
（3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）；
（5）酶标记物及样本的稀释液；
（6）洗涤液； （7）反应终止液。
ELISA试剂盒
ELISA试剂的作用
• 2.1 免疫吸附剂：
已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 • 固相载体：
判断题（8题，每题1分）
填空题（23题，每题1分）
名词解释（5题，每题3分） 简答（6题，每题7分） 实验设计（1题，每题12分）
第七章 酶联免疫吸附分析
• 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激 机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产 生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致 敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 • 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免 疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结 合的免疫球蛋白。 • 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、 反应的等比例性
• 2.3 酶的底物
• 2.3.1、HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为 H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2
一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比
色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检测 抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
2.6 对照品
• 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如 HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg。
• 阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一 定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量 应与试剂的敏感度相称。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检 测敏感度约为0.5 ng/ml，阳性对照品中含量约为10 ng/ml。在 对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
4、保温
在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称 为温育(incubation)。 • ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。 加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合 的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。 这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。 在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是 为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
可以用分光光度计（酶标仪）加
以测定。
方法简单，方便迅速，特异性
强。
ELISA原理
酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体 或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂， 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示
出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保 留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶 联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性， 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈
颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光 学显微镜、电子显微镜观察，也
5、洗涤
目的：分离游离的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能 与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于 固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的， 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 洗涤的方式：自动洗涤仪与手工操作。
a.吸干或甩干孔内反应液；
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别洗涤 除去未结合 的成分
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量
ELISA特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大 量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。 因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了 在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在 部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定 量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定 法的敏感度约为5-10μg/ml 。
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
二、ELISA试剂
• ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶 的底物。
• 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：
b.用洗涤液过洗一遍; c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，
间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；
d.吸干孔内液体; e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。
抗原-抗体识别反应示意图
一、ELISA原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后 通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可 以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）
②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
ELISA原理
2.3.1 HRP的底物
• OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有 最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须 现配置现用。 • TMB经HRP作用后产物显蓝色，酶反应用HCl或H2SO4终止后， TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为 405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混 和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等 优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。。
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反 应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于 EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔 式。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各 板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
2.7 标准品 • 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品， 应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护 剂及防腐剂的缓冲液中。
三、ELISA实验过程
1、样品的采集与保存 2、试剂的准备 3、包被 4、加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样
Hale Waihona Puke 本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。
应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
β-Ｄ－半乳糖苷 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 酶
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
ELISA法间接法测定抗体
1.原理
（三）竞争法
对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物 显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞 争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固 相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后 显色反应较弱。