(5) 吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
(6) 展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。
2cm
图1. 点 样
展层剂
展层剂
图2. 滤纸的缝合
3、平衡 点样以后将滤纸与层析缸用配好的 溶剂系统蒸汽来饱和，这个过程称为平衡 (30min) ,否则，滤纸会从溶剂中吸收水分，溶 剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组分发 生改变，严重时纸上会出现不同水平的溶剂前 沿，影响层析效果。
4、展层 向层析缸中加入层析溶剂（高约 1.5cm） ，液层不要超过点样线，将滤纸点样 点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶 剂到达滤纸上边线1-2cm时取出冷风吹干。
实验二、纸层析法分析氨基酸
一、实验目的
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。
2.了解氨基酸的特征性颜色反应。
3.原理
纸上层析法是分配层析法中的一种，常以 滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定 和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质 的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、 操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代 生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应 用于科研和生产分析工作中。
纸上层析的原理
常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶 剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后 的水相, 一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于 滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力, 其吸附的水相为固定相, 有机溶剂相为移动相。 由于物质的极性大小不同,在两相中分配比例 有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多,随 有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配 较多,移动相对较慢,从而将极性不同的物质分开
图3. 层析谱
1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿
五、注意事项
(1) 在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘， 否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。
(2) 在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm）， 防止氨基酸斑点重叠。 (4) 展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与 滤纸平行。
三、实验操作
1、纸的处理
取18 cm长、18 cm宽的滤纸一 张，离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行 的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈， 使圈的直径小于0.4 cm。
2、点样 用毛细管点样，中间点混合氨基酸， 两侧点三种标准氨基酸；每个点样点重复点2-3次， 每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷 风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径 应控制在2-4mm左右，点样完毕用大头针线将滤 纸做成筒形，点样面向里。
在相同的条件下，每种物质都有其固定 的Rf值。 Rf值的定义为： 原点到层析斑点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
影响Rf值的因素有：
①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。
用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。 若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析 条件，根据文献Rf值进行鉴定。
5、显色
用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚 三酮，热风吹干(加快反应)反应显色(或晾干后， 将滤纸放入烘箱中80-100℃，烘烤5分钟后 )，滤 纸上即显出紫红色或黄色的氨基酸斑点。
四、结果处理
1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来。 2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离， 计算各种已知氨基酸和未知氨基酸色谱的Rf值。 3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。