➢离心 ➢电泳 ➢层析 ➢光谱
What should we do
➢预习： ➢操作：安全&什么是动手能力强？ ➢记录：Raw Data ➢总结：
实验记录
➢ 实验前预习，了解要学习的主要内容。
➢ 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、 试剂的浓度等。
离不能太近。 4、吹干时一定要保证完全吹干。
5、缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并 且底边应对齐，点样线一面滤纸朝外。
6、点样时，样品扩散圈不能过大，直径小于 3mm。
7、使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球 并用食指堵管口。
8、使用移液管时，应先看清管的最大刻度， 每一格代表多少后再量取。
9、 15ml水是用蒸馏水，在水槽边的大玻璃瓶中。 10、 实验结束请清洗实验玻仪，但不要清洗展层缸
1氨基酸的分离---纸层析法
A Multidisciplinary Science
Chemistry
Biology
Biochemistry
Genetics
Pharmacology
Molecular Biology
Cellular Biology
Biotechnology
生物化学实验
➢介绍生物化学实验的原理和方法
实验一 氨基酸的分离鉴定 ——纸层析法
【实验目的】
学习氨基酸纸层析法的基本原理
掌握氨基酸纸层析的操作技术
纸层析法属于分配层析，它是以层析滤纸为 载体，以吸附于滤纸纤维羟基上的一层水（极性） 为固定相，流动相是有机溶剂，主要是正丁醇 （非极性溶剂）。分离氨基酸是根据不同氨基酸 的极性，在固定相和流动相中的分配系数不同而 进行分离的（依据相似相溶原理）。
酮正丁醇溶液
【实验步骤】
1、配扩展剂： 正丁醇：冰醋酸：水= 20ml ：5ml ：15ml 顺序：正丁醇→冰醋酸→水，放入分液漏 斗中，充分混匀。静置约10min后分层，放 出下层水层，其余的倒入培养皿中。
2. 准备滤纸
取一张层析滤纸，距纸底边2cm处用 铅笔划一横线，沿线每隔2.5cm作一记 号为点样处，点样处也不要太靠近两侧 边（约距1.5cm），会产生边缘效应。
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小 与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析 温度等因素有关。
【实验器材与试剂】
1、层析缸 2、毛细管 3、喉头喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸 6、铅笔（直尺） 7、分液漏斗 8、吹风机
9、 正丁醇 10、冰醋酸 11、氨基酸标准样品 12、氨基酸混合样品 13、0.1%水合茚三
【实验原理】
分配层析:
利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系 数不同而使物质分离的方法。
分配系数:
是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达 到平衡时，该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比。 不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同，因 而也就有不同的分配系数。
。
氨基酸被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比 移值)来表示的。
3.点样（顺纸纹方向）
用毛细管依次吸取标准品氨基酸和 混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸 面，样品扩散直径小于3mm。一滴滴完
后用冷风(低温）吹干，再点第二次，
共点三次。
4.扩展
将点完样的滤纸两侧面对齐， 用针线缝合，纸的两边不能接触。 将点样后的滤纸直立于培养皿的 扩展剂中，（点样的一端在下， 扩展剂的液面需低于点样线1 cm ） 当溶剂展层至滤纸上沿2cm处展 层结束，取出滤纸。用铅笔画出
缝合滤纸，注意两边缘不能接触。
层析
将滤纸垂直放置在培养皿中，盖紧缸盖。 层析结束后 取出滤纸，电吹风吹干，划前沿线。
显色
喷雾器均匀喷上茚三酮溶液，电吹风热风吹 干至看到AA彩色斑点。用铅笔将图谱上的 斑点圈出，测Rf相关值。
下次实验
总氮量的测定－凯氏定氮法 （405实验室）
氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的 一类有机化合物的通称。生物功能大分子 蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养 所需蛋白质的基本物质。是含有一个碱性 氨基和一个酸性羧基的有机化合物。氨基 连在α-碳上的为α-氨基酸。组成蛋白质的氨 基酸均为α-氨基酸。
及其中的培养皿。
11、有机废液倒入右侧实验台上的“废液收集有机 溶剂”大试剂瓶中。
12、 实验结束, 回收竹夹子、A4复印纸、电吹风。 13、实验报告要写同组同学号数、名字，层析滤纸
贴在其中一位同学的实验报告上。
14、坐椅推入实验台下，空出过道。
【结果分析与讨论】
【思考题】
通过本次实验，讨论下列问题： （1）简述纸层析的原理。 （2）判断氨基酸极性大小顺序，讨论AA极
展层前沿位置，在通风橱中用 热风吹干。
5. 显色
用喉头喷雾器均匀 喷上0.1％茚三酮正丁 醇溶液，然后用热风 吹干即可显出各层析 斑点。
6. 测量、计பைடு நூலகம்：
分别测量X、Y值， 计算各氨基酸的Rf值。
Rf= X÷Y
注意事项
1、手尽量小心接触滤纸，顺纸纹方向层析。 2、吸取样品的毛细管不可混用。 3、点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距
性与Rf的关系？ （3）什么是Rf值？影响的主要因素是什么？
展层剂的配制
正丁醇 : 冰醋酸 : 水=20mL : 5mL : 15mL放置 分液漏斗中，塞上塞子，充分振荡，静置分层。 （先混和正丁醇和冰醋酸）弃下层水层。放 10mL左右于培养皿中，并置于密闭的层析缸中。
操作流程：
点样 滤纸一边2厘米处划线，在线上等距离划5个点。 毛细管吸样品点样，直径小于0.3cm， 电吹风吹干，重复一次。干燥后将滤纸卷成圆形，
➢ 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量 的数据。即使观测的数据相同或偏差很大，也都 应如实记录，不得涂改
实验报告（A4大小纸，计算成绩！)
➢ 实验目的 ➢ 实验原理 ➢ 仪器、材料和试剂 ➢ 实验步骤 ➢ 结果讨论（含数理据处） ➢ 注意事项
成绩
➢考勤 ➢课堂表现 ➢实验报告 ➢笔试 ➢实际操作考试
➢动手!
使用各种生物化学实验仪器，掌握生物化学 的各种基本实验方法和操作技能 ➢加深对生物化学理论知识的认识和理解。
What should we get
➢设计一个实验的基本思路，根据掌握的实 验基本原理，严密地组织自己的实验，合 理地安排实验步骤和时间－－去解决所需 要解决的问题。
生化实验四大 必杀技