微生物学实验三
化脓性球菌的分离鉴定
（综合性试验） 微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
录像：消毒灭菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 2. 3. 4. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 普通平板、血平板、黑纸片等
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。 2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个 胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNA的 分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大： >20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感
<10mm:
不敏感
无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）

化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的 方法。


防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。

无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
7. 注意操作中始终保持无菌操作
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射

β射线和γ射线； 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导 致酶系统功能紊乱等; γ射线有较高穿透力； 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用 于食品消毒，不破坏其营养成分。

滤过除菌：
物理阻留；
用于不耐高温的血清、
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法 湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、 煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法 紫外线 电磁波辐射杀菌法 电离辐射 滤过除菌法 超声波杀菌 干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰 2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢，
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。
3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装）
4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人）
2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线
3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果

常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑
脊液等。 本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定

化脓性球菌分离鉴定步骤
37℃ 接种 血平板 脓汁 菌落 划线法 24h
革兰染色
葡萄状排列 链状操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。 优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术 掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：

消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。
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抗生素、药液等的除菌。
高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带 来了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。 药敏试验的常用方法：纸片法