根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案
一、方法：
稀释涂布分离法
二、培养基：
1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar)
2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB ）
3、金氏培养基B （King ）
4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar)
5、YG
6、NA
7、无氮培养基
8、分解纤维素菌筛选培养基
9、TSA 培养基 三、实验流程
梯度稀释 涂板分离
挑取不同的单菌落于斜面培养 液体培养及液体保种 提取DNA
PCR 扩增 酶切带型分型确定操作单元
连接转化 克隆子挑选及PCR 鉴定 测序 序列拼接 建树 采集根际土壤样品
四、具体实验方案
1、采集根际土壤样品：将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。

2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离：梯度稀释土壤样品，取10-1、10-2、10-
3、10-
4、10-
5、10-6六个梯度涂板，每个浓度梯度涂3个平行，过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。

选择合适的浓度平板，根据形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，达到分离纯化的目的。

3、挑取不同单菌落于斜面保种：通过上述的分离纯化步骤，可筛选得到不同的菌株，对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。

最后斜面放于4℃冰箱保存，备用。

4、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min，37℃）培养。

过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。

剩下的菌液用于以下实验。

5、提取DNA（CTAB法）：
（1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。

（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），混匀，于55℃温育1h。

（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。

（6）冷却后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP 管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。

（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。

（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。

（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

（10）加入50ul 双蒸水溶解DNA于4℃保存。

（11）电泳检测
6、PCR扩增：将提取得到的DNA进行PCR扩增（引物：27F
和1495R），电泳检测扩增得到的16S rDNA。

7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII
两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。

8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进
行连接实验。

将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。

9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于
含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行P CR扩增鉴定（引物：M13-47和RV-M），将含有目的片段的克隆子菌液低温保存。

10、测序：将含有目的片段的克隆子菌液送去测序。

11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼
接。

12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，最后将比对得
到的所有序列运用MEGA6建立系统发育树。

培养基配方：
1、CSEA培养基(Cold extracted soil extract agar)
土400g,H20 1000 ml，将加有玻璃珠的三角瓶放在摇床上摇匀充分打散，1OOOgX 1Omin离心，上清经过滤纸过滤后即为土壤浸提液。

121 0C , 60 min高压蒸汽灭菌。

2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl5
g、琼脂15-20 g、蒸馏水1000 ml、pH7.0-7.2
3、分解纤维素菌筛选培养基(Cellulolytic Bacteria Medium)：羧甲基纤维素钠10g、酵母膏1g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH7.2
4、GPM培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar)：蛋白脉
5g,葡萄糖lOg，牛肉膏5g,氯化钠3g，去离子水定容至1,OOOmL, pH7.0。

配制固体培养基时加入15g琼脂。

5、金氏培养基B（King）：蛋白胨20g、甘油10g、磷酸氢二钾
1.5g、硫酸镁1.5g、蒸馏水1000ml、pH7.0-7.5（针对分泌IAA的菌株）
6、YG培养基：酵母膏0.3%,胰蛋白胨0.5%,葡萄糖0.5%,蒸馏水1000 ml，pH9.（针对芽孢杆菌）
7、无氮培养基：甘露醇（或葡萄糖）10 g、磷酸二氢钾0.2 g、七水合硫酸镁0.2 g、氯化钠0.2、二水合硫酸钙0.2 g、碳酸钙5 g、蒸馏水1000 ml、pH7.0-7.2（针对固氮菌，根瘤菌）
8、NA:蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、葡萄糖2.5g、酵母粉1.0g、琼脂粉20g、蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2
9、TSA培养基:胰蛋白陈17g,大豆陈3g,氯化钠5g，葡萄糖2.5g, K2HP042.5g,去离子水定容至1,OOOmL, pH7.3,配制固体培养基时加入15g琼脂。

10、2×YT：蛋白胨 16g，酵母膏10g，NaCl5g、蒸馏水1000ml，pH7.0。

琼脂20g。

11、YPD:蛋白胨 20g,酵母提取物 10g,葡萄糖 20g,琼脂20g，pH7.2±0.2。

12、。