碱性蛋白酶的分离纯化与性质初探一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义:1.国内外研究现状碱性蛋白酶(Alkaline protease)广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中，1913年Rhom首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。

1945年瑞士的Dr.Jagg 等发现了微生物碱性蛋白酶,使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。

碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途。

由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点之一[1]。

研究结果发现，海洋酶具有作用pH 范围宽，最适pH 和反应温度适中，随反应温度的降低酶活性下降缓慢等特点。

海洋酶所具有的独特性质，引起学术界高度重视，日、美等国就此展开了深入的研究。

迄今为止，由海洋微生物生产海洋酶的专利已达20 余项。

海洋微生物酶的研究正逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径[2,3]。

相比之下，国内在海洋碱性蛋白酶研究方面差距较大。

综合多篇文献分析，目前针对海洋细菌产生的碱性蛋白酶，分离提纯的方法大致多采用饱和硫酸铵分级盐析和层级技术。

首先是从发酵液取上清制备粗酶液（此酶为一种外分泌蛋白，无需通过溶菌酶溶解或超声波破碎细胞来制备粗酶液），通过超速离心沉淀，饱和硫酸铵分级盐析，透析，凝胶层析或离子交换层析来分离提纯该菌所产生的碱性蛋白酶。

其中一些已经对酶的性质、序列等进行了研究[4-7]。

2.选题依据及意义此毕业设计的课题为《碱性蛋白酶的分离纯化及性质初探》，主要是对海洋细菌进行培养及分离提纯方案的改进，并对其性质进行初步探究。

大致是将各种相关参数和实验数据建立正交关系得到最佳培养条件，并对其产生的碱性蛋白酶进行分离提纯，同时得出最佳分离提纯方案。

最后对碱性蛋白酶的性质进行初步研究。

本设计针对目前研究较少的产碱性蛋白酶的海洋微生物新菌株，研发新型高效的碱性蛋白酶，这对满足人类生活、生产与技术开发的需求至关重要。

这种积极采用微生物代替化学法的探究，有利于开发现代生物新产品的工业化生产技术研究，有利于加快现代生物领域产业的发展。

二、研究的基本内容，拟解决的主要问题1.海水中碱性蛋白酶高产菌株的筛选；2.发酵液中碱性蛋白酶的分离提纯（主要目标）；3.目标碱性蛋白酶的性质初探（初步预计目标碱性蛋白酶的科研价值）；4. 结果分析（得出结论，为下一步科研工作打下基础）。

三、研究步骤、方法及措施1. 实验材料1.1菌种: 燕山大学生物实验室筛选产碱性蛋白酶海洋菌株。

1.2分离纯化材料考马斯亮蓝，南京建成生物工程公司；葡聚糖凝胶层析柱，SDS分析纯，中药集团上海化学试剂公司；等等。

2. 实验方法2.1生物量测定用722 型分光光度计测定发酵液的OD值作为生物量指标。

2.2蛋白酶活力测定先将1 % 酪蛋白放入40 ℃恒温水浴中，预热 5 min；取适当稀释的酶液 1.0 mL，加预热后的酪蛋白1.0 mL 摇匀，并在40 ℃下保温10 分钟：加0.4 mol / L 三氯乙酸2.0 mL 摇匀，取出静止10 min，过滤；取l.0 mL 滤液，于40 ℃下加0.4 mol / L 碳酸钠溶液 5.0 mL，接着加福林试剂使用液 1.0 mL 并保温20 min。

在680 nm 波长下比色，测其吸光度[8,9]。

酶活计算方法：X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n式中：X，样品的酶活力（μ/g或μ/mL）；A，样品平行实验的平均吸光度；n，稀释倍数。

K，吸光常数，K=95.3（说明：测定空白时，加酪蛋白与三氯乙酸的顺序相反）2.3分离提纯工艺流程2.3.1粗酶液制备发酵液经10000r/ min低温离心10min, 取其上清液作为粗酶液2.3.2 酶的盐析取9 个容量瓶分别加入发酵上清液20 mL，搅拌下加入硫酸铵，使其饱和度分别为0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，在20 ℃水浴中保温2 小时，滤纸过滤后，分别测定滤液的碱性蛋白酶活力。

根据测定结果，以硫酸铵饱和度为横坐标，酶活为纵坐标，绘出该酶的盐析曲线。

确定除杂蛋白和沉淀碱性蛋白酶的A饱和度和B饱和度硫酸铵[10,11]。

2.3.3酶的丙酮沉淀酶液中加入不同体积的丙酮（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，离心收集酶沉淀。

同时测定不同丙酮加入量下的上清与沉淀中碱性蛋白酶的活力，得到使沉淀蛋白的酶活力最大的丙酮加入量，并记录数据，同盐析沉淀对比。

2.3.4 酶的分子量测定取部分沉淀，进行电泳，初步测定分子量，根据数据选择合适孔径。

2.3.5 酶的分离层析发酵上清液中加入最适体积的丙酮或硫酸盐（20 ℃），放置 2 ~ 3 h，1000 rpm离心5 min 得到沉淀，冷冻干燥。

冻干的酶粉溶解于50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，不能溶解的部分可以离心除去。

此溶液在相同缓冲液中透析。

1 mL 透析的酶液上葡聚糖凝胶过滤柱（合适孔径），用50 mM pH 10.0 的甘氨酸-NaOH 缓冲液进行洗脱，流速调节为15 mL / h。

收集活性峰，于- 20 ℃下进行储存[12]，进行酶学性质的实验和下一步的纯化。

2.3.6碱性蛋白酶的活力测定方法同2.2。

2.3.7蛋白质含量的检测采用Lowry 法进行测定。

酶的分离纯化过程中，采用280 nm 紫外检测。

2.3.8 SDS-PAGE 电泳利用SDS-PAGE 凝胶电泳测定碱性蛋白酶的纯度及分子量。

酶液与样品缓冲液在100 ℃下加热 5 min 变性。

电泳在40 mA 下进行，蛋白带用考马斯亮兰R-250 进行现色[13]。

2.4 酶学性质的研究2.4.1 pH对酶的影响pH的影响分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。

酪蛋白底物溶解于不同的缓冲液体系中：Tris-HCl pH（7.0 ~ 8.0），50 mM 甘氨酸-NaOH 溶液（pH 9.0 ~ 13.0）。

检测酶反应的最适pH 值，以最适反应pH 下测定的最大酶活为100 % 酶活力。

将纯化的储存酶溶解于上述缓冲液中，30 ℃下保存l h，检测残余活性。

2.4.2 温度对酶活性的影响温度的影响也分别从对酶的稳定性与活性这两个方面研究。

将纯化的储存酶溶解于50 mM pH 10.0 甘氨酸-NaOH 缓冲液，置于封闭的Eppendorf 管中，在不同温度水浴中保温不同时间，测定残余酶活力。

于10 ~ 80 ℃范围内检测碱性蛋白酶的活性，确定酶反应的最适温度。

2.4.3 酶动力学曲线及米氏常数的测定配制不同浓度的酪蛋白底物（最适pH），测定最适温度下不同底物浓度下酶反应的初速度。

用双倒数作图法（Lineweaver –Burk），以初速度的倒数对底物的倒数作图，求得最大酶反应速度Vmax 和米氏常数Km 值[14,15]。

2.4.4 金属离子对酶活的影响将纯化的储存酶溶解于50 mM最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中，与不同离子在最适温度下共同保存l h，后测定残余活性。

2.4.5 有机溶剂对酶活的影响材料为实验室所有有机溶剂如苯、甲苯、二甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、环己烷、正庚烷、无水乙醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃等。

经过有机溶剂处理过的酶，在37℃下进行酶促反应10min，测定转化后的A280（与酪蛋白浓度成正比）。

2.4.6 碱性蛋白酶的稳定性将无细胞发酵液与精制酶（适量丙酮对无细胞发酵原液进行沉淀，沉淀的酶蛋白溶于50 mM 最适pH的甘氨酸-NaOH 缓冲液中）分别于室温与 4 ℃下贮藏，每15 天分别测定发酵液与精制酶的活力，考查其稳定性。

四、研究工作进度1-3周查阅相关文献资料，设计试验方案，写开题报告，任务书和文献综述；4-8周配制试剂、菌种筛选，进行试验；9-14周碱性蛋白酶的分离纯化，性质实验测定，数据处理等；15-16周结果分析；撰写毕业论文；17周论文评阅、答辩。

五、主要参考文献[1] 冯静, 谢慧君, 马桂荣. 一株海洋细菌产碱性蛋白酶的研究. 生物技术, 2001, 11(3):11-13.[2] 李丹, 陈丽, 李富超等. 一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性. 食品与生物技术学报, 2007, 26(6): 74-80. [3] 孙谧, 王跃军, 张云波等. 一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究. 海洋水产研究,2000,21(4): 1-5.[4] 吕明生, 陈静, 王淑军等. 海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株的筛选研究. 江苏食品与发酵, 2004, (1): 7-10.[5] 韩斌, 张林丰. 现代生物化工中酶工程技术研究与应用. 北京农业, 2008, (33): 37-39.[6] HAO Jian—Hua, W ANG Yue—Jun, LIU Jun ,et al. Cloning and Characterization of Marine Bacterium QD80 Cold Alkaline Protease. Chinese Journal of Bioehemistry and Molecular Biology, 2005, 21(4): 465-470.[7] 邓菊云. 微生物碱性蛋白酶研究进展. 现代食品科技, 2008, 24 (3): 293-296.[8] 荆谷, 谢慧君, 孔健. 海洋细菌Pseudomonas sp. 7211产碱性蛋白酶的研究. 山东大学学报(理学版), 2002, 7(3): 264-267.[9] 路炳声, 黄志强, 林白雪等. 海洋氧化短杆菌15E产碱性蛋白酶的发酵条件. 福建农林大学学报(自然科学版), 2007, 36(6): 591-594.[10]Rai SK ,Mukheljee AK. Ecological significance and some biotechnological application of an organic solvent stable alkaline serine protease from Bacillus subtilis strain DM-04. Bioresource Technology , 2009, 100 (9): 55-59.[11]Chaganti Subba Rao,Thadikamala Sathish,Pendyala Brahamaiah,et al. Development of a mathematical model for Bacillus circulans growth and alkaline protease production kinetics. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2008, 84 (2): 112-116.[12]龙敏南, 苏文金, 张凤章等. 光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶的分离提纯及特性. 中国生物化学与分子生物学报, 2000, 16(6): 710-715.[13]肖云晓, 庞辉肖. 螺旋藻激酶分离提纯方法初探.时珍国医国药, 2001,22(6):1399-1400.[14]喇文军. 蛋白质、蛋白酶以及短肽类的分离提纯技术及应用. 食品工程,2008,(1):15-29.[15]顾艳丽, 刘赛男, 张慧等. 菌株I13产碱性蛋白酶的酶学性质研究. 安徽农业科学,2010, 39 (13): 7574-7575.六、导师意见指导教师（签字）年月日七、审核意见：审查结果： 1、通过； 2、完善后通过；3、未通过负责人（签字）：年月日。