实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。
酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。
①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。
因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km 值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。
③Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。
方程式与图如下：本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。
实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。
二、实验材料（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定１、样品兔肝２、试剂①0.5mol/L乙酸镁溶液②0.1mol/L乙酸钠溶液③0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液④0.01mol/L Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.８缓冲液⑤丙酮（分析纯）⑥95%乙醇（分析纯）⑦正丁醇（分析纯）⑧0.04mol/L底物液⑨１mg/ml分标准液⑩0.5mol/LＮａＯＨ⑪0.3% 4－氨基安替比林⑫0.5%铁氰化钾⑬0.1mg/mL蛋白标准液⑭碱性铜试剂⑮酚试剂３、仪器与器材①研钵②刻度离心管③刻度吸管④电动离心机⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盘天平⑦恒温水浴⑧可见分光光度计（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响１、样品兔肝匀浆液２、试剂①0.04mol/L底物液②0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）③碱性溶液④0.5%铁氰化钾⑤0.3% 4－氨基安替比林⑥酚标准液（0.1mg/ml）３、仪器与器材①恒温水浴锅②可见光分光光度计三、实验步骤（一）AKP的提取AKP提取实验步骤步骤操作（１）匀浆2g新鲜兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀浆。
匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为Ａ液吸取Ａ液0.1ml于另一试管中，加PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释Ａ液（1:50），供此比活性用（２）除杂蛋白在Ａ液中加入正丁醇 2.0ml，用玻璃棒充分搅拌2min，室温放置20min，用滤纸过滤（３）丙酮沉淀AKP 滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2000r/min）5min（４）AKP 溶解沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为B液。
取B液0.1ml于另一试管中，加入PH8.8Tris缓冲液4.9ml，此为稀释B液（1:50），供动力实验用(二) AKP的比活性测定1、AKP的活性测定AKP活性测定实验步骤步骤操作（1）加缓冲液取试管3支，按表操作试剂（ml）测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液---- ----- 1.00.04mol/L底物液1.0 1.0 1.0（2）温浴37℃水浴预温5min(3)加酶和底物0.1mol/ml标准酚应用液待测液---- 1.0 ---- 1.0 ---- ----(4)酶促反应37℃准确保温15min(5)加显色液0.5mol/LNaOH 1.0 1.0 1.0 0.3% 4－氨基安替比林1.0 1.0 1.0 0.5%铁氰化钾2.0 2.0 2.0(6)显色反应混匀，室温放置10min(7)测吸光度510nm处测吸光度2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验步骤步骤操作（1）反应体系设置取3支试管，按表操作试剂测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液---- ---- 1.0待测酶液 1.0 ---- ---- 蛋白标准液（0.1mg/ml）---- 1.0 ---- 碱式铜试剂 5.0 5.0 5.0（2）反应混匀后室温放置10min（3）加酚试剂酚试剂0.5ml（4）显色反应混匀后室温放置30min（5）比色反应在510nm处比色（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反应速度的影响将新鲜兔肝用PH10.0 0.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制步骤步骤操作(1)反应体系设置取6支试管标号，按表操作试剂（ml）1 2 3 4 5 60.01mol/l底物液0.01 0.20 0.30 0.50 1.00 ----- PH100.1mol/L碳酸盐缓冲液0.07 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.70 0.20 1.20(2)保温37℃水浴中保温5min(3)加酶各管分别加入兔肝稀释匀浆液0.10ml（4）酶促反应混匀，立即记录时间，将各管准确保温15min（5）终止反应各管分别加入碱性溶液1.0ml（6）加各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0ml显色剂各管分别加入0.5%铁氰化钾2.0ml （7）显色充分混匀，放置15min（8）比色测定以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定（9）反应速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量，算出反应速度（10）曲线绘制以各管底物浓度的倒数（1/[|S]）为横坐标，以各管反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，作图求出Km值2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制步骤步骤操作（1）反应体系设置取洁净干燥试管6支，依次加入试剂试剂（ml）1 2 3 4 5 6 0.1mol/ml酚标准溶液---- 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60（2）预37℃水浴中保温5min加热（3）加显色剂碱性溶液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3% 4－氨基安替比林1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.00.5%铁氰化钾2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0（4）显色反应混匀后，室温放置15min（5）比色测定510nm波长处比色（6）曲线绘制以酚含量（微克）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚标准曲线注意事项（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。
2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。
3、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、血清取量要准确。
2、标准曲线必须是过原点的一条直线。
3、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致。