珠子参DNA的不同提取方法的研究摘要：目的：探讨适合ssr标记的dna不同提取方法。
方法：用经典catb法,改良catb法， sds法，高盐低ph法，提取新鲜珠子参根部中总dna，并对dna进行电泳得出最佳提取方法。
结论：最佳提取方法为改良catb法。
关键词：珠子参； dna提取；ssr分析； catb法；sds法；高盐低ph法beads and dna from different methodsyangshen(yuxi teachers college, resources and environment college, biological science)abstract: objective: to study the different extraction methods of the ssr markers for the dna. methods: using classical catb method, advanced catb method, sds method, high salt low ph method, fresh and root extract beads of total dna, and through electrophoresis obtains the best extraction method. conclusion: the best extraction method for improvement catb method.keywords: beads; dna extracted; ssr analysis; catb method; sds method; high salt low ph method珠子参(panacismajirisrhizama)属于五加科、串珠状根茎植物，别称钮子七、珠儿参、扣子七。
分布于我国的四川、陕西、云南等省。
具有活络、止血的功效 [1-2]。
现代药理学研究显示, 珠子参具有较广泛的药理作用, 对心血管系统、血液及造血系统、免疫系统、肿瘤等均有作用[2]。
因此珠子参具有极高的研究价值，所以本实验用珠子参作为材料进行实验。
珠子参根部次生代谢产物较多，其中酚类多糖类物质会影响珠子参总dna的提取及srr分析。
本实验主要为了选取适合ssr分析的dna不同提取方法的最佳方法，以便更加有效地提取珠子参总dna。
1材料与实验方法及操作1.1材料1.1.1实验材料实验材料取自大理市鹤庆县草海镇马厂的珠子参。
该实验需要用到不同的提取方法及不同的保存方法，所以将各类方法和保存方法做如下标记：a、经典ctab法，b、改良ctab，c、sds法，d、高盐低ph值法。
1.1.2仪器离心机，水浴锅，冰箱，电泳仪，移液枪，rcp扩增仪，凝胶成像仪1.1.3试剂ctab提取缓冲液：(10.00gctab，50.0ml 1mol/ltris-hcl(ph8.0)，20.0ml 0.5mol/l edta，41.00g nacl，定容至500ml）；3%sds提取缓冲液：(0.1mol/l tris-hcl（ph8.0），0.05mol/ledta-na2， sds，定容至250ml)；去多糖buffer：(100ml tris-hcl(1mol/l)，50mledta(0.5mol/l），nacl7.305g，定容至500ml)；高盐低ph值提取缓冲液：(0.1mol/l、ph=4.8 naac,0.05mol/l、ph8.0 edta-na2，0.5mol/l nacl，2%pvp，2%sds，ph=5.5)；te：(5ml 1mol/l tris-hcl，1ml 0.5mol edta, 定容至500ml)；3%琼脂糖凝胶：(0.6g琼脂糖,20ml 1%tbe缓冲液)；10x的tbe：（tris碱108.00g，edta7.44g，硼酸55g,定容至1000ml）；40%的聚丙烯酰胺凝胶：（双丙烯酰胺2.00g，丙烯酰胺38.00g，定容至100ml）；6%的聚丙烯酰胺凝胶：（10xtbe 12ml，40%聚丙烯酰胺凝胶18ml，90ml h2o）；银染所需试剂：（0.1%agno3溶液，3%na2co3溶液,10%hac溶液,1%na2s2o3溶液）；0.5mol/l edta，β-巯基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，tris饱和酚，氯仿/异戊醇(v/v=24:1)，异丙醇，75%乙醇，琼脂糖，无水乙醇，5mol/l kac，1x的tbe，temed，aps，硝酸，二甲苯氰，溴酚蓝1.2实验方法及操作1.2.1 经典catb法[3] (有改动)(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μl 65℃预热的ctab提取缓冲液混匀；(2)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中，保温60min,每隔15min温和颠倒混匀； (3)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，取上清液于另一离心管，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，混匀后至溶液呈乳浊状，10000r/min离心10min；(4)小心将上清液相转移至另一个1.5ml离心管中，标号a1，a2，a3，在上清液中加入600μl预冷-20℃的异丙醇，轻轻混匀，至有白色絮状沉淀出现，-20℃静置保存1小时。
(5)离心管从冰箱取出后10000r/min离心10min弃上清液，沉淀dna；(6)用400μl 75%的乙醇洗2次， 7000r/min离心3min弃上清液；(7)然后再用400μl 无水乙醇洗，7000r/min离心3min弃上清液，然后置于空气中干燥；(8)沉淀干燥后溶于加有100μl 的te溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。
1.2.2改良catb法[3-4] (有改动)(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入少许石英砂和pvp，加入1.2ml的buffer去多糖和24μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)10000r/min离心10min 弃上清液；(3)向3个1.5ml离心管中加入600μl 65℃预热的ctab提取缓冲液同时加入24μlβ-巯基乙醇，用毛细玻璃管搅拌充分；(4)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中保温60min，每隔15min温和颠倒混匀；(5)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，每管加入240μlkac，放入冰箱-20℃60min；然后10000r/min离心10min (6)小心将上清液相转移至一干净的1.5ml离心管中，同时加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，放入垂直振荡器中充分混匀10分钟，然后10000r/min离心10min；(7)取上清液且分别标号b1，b2，b3干净的1.5ml离心管中，然后加入640μl -20冰浴的异丙醇，放入-20℃冰箱冷冻60min；(8)取出后在10000r/min离心10min沉淀dna，弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的te溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。
1.2.3sds法[5-6] (有改动)(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μl sds提取缓冲液，并加入240μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次；(3)待冷却后加入230μl 5mol/l kac,混合后冰浴60min；(5)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，然后放入垂直振荡器中充分混匀10分钟；(4)取出后10000r/min离心10min；(5) 取上清液于分别标号c1，c2，c3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀dna；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的te溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。
1.2.4高盐低ph值法[7-8] （有改动）(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中分别加入1200μl 高盐低ph值提取缓冲液，充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次； (3)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入600μl kac溶液，然后混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min ；(4)取出后10000r/min离心10min；(5) 取上清液于分别标号d1，d2，d3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀dna；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的te溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。
1.3 pcr扩增[9] （有改动）将4种提取方法所提取的总dna于nyc technik inc生产的atc201 pcr扩增仪用ssr分析[10]进行扩增。
反应体积25μl，引物：5’-tagtagcgacgatcaccacg-3’。
pcr扩增反应体系如下（1μl tap酶,1μl dntp(10mm),5μl 10xbuffer(mg2+ 20mm),1μl primerf, 1μl primerr, 1μl dna模板（约50ng）,15μl h2o）。
pcr扩增体系如下（94℃5min,(94℃45s,53℃1min,72℃1min30s进行36次循环)，72℃7min, 4℃保存）。
1.4琼脂糖凝胶电泳用3%的琼脂糖凝胶对4种提取总dna进行电泳。
然后用凝胶成像仪拍照。
1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染[11-12]（有改动）先用6%的聚丙烯酰胺凝胶与促凝剂temed和aps混合制作胶版，然后用pcr扩增出来的样品与溴酚蓝混合后进行点样，250v电泳150min。