包涵体得形成以及处理方法
1包涵体形成得原因
(1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体L２]。
原因可能就是合成速度太快,以至于没有足够得时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间得非特异性结合,蛋白质无法达到足够得溶解度等。
(2)重组蛋白就是大肠杆菌得异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。
(3)重组蛋白分泌序列得存在阻碍折叠,导致错误折叠分子得产生。
(４)重组蛋白得氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
(５)包涵体形成动力学研究表明,包涵体就是由部分变性得中阃体聚合而成。
因此,任何影响中间体稳定得因素,如pH值(ｐＨ接近蛋白得等电点时容易形成包涵体)离子强度与温度都可以引起蛋白聚合反应。
(6)在细菌分泌得某个阶段,蛋白质分子间得离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体得形成、(７)有报道认为,丰富得培养基有利于活性蛋白质得表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体？。
包涵体得处理
包涵体得形成具有有利得一面,也有不利得一面、有利得一面就是包涵体得形成去除了几乎全部得细胞内可溶性蛋白质。
同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物得降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白得１0％～30％,甚至高达５0％。
不利得一面就是溶解包涵体进行复性折叠得过程中需要加变性剂与去垢剂,而引起蛋白质得不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性得操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解与沉淀,有些还形成异构体【s] ５。
因此复性就是蛋白质工程中最关键、最复杂得问题。
包涵体得处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞
提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌得过程中目得蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适得缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加
入保护剂,如还原剂DTT(２一巯基苏糖醇)、２一巯基乙醇;加防止水解酶作用得试剂,如酶得抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
破菌得方法很多,主要包括以下几种:(１)渗透破碎法:
这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
(2)冷热交替法:把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎、可用于提取蛋白质与核酸。
(3)反复冻融法:把待碎样品冷却到一2Ｏ℃,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内得颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。
这种方法虽简单方便,但对温度变化敏感得蛋白质却不宜采用。
(4)超声波法:使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎、根据不同待碎样品采用不同频率,不同时间;另外,超声波处理时溶液温度升高会使不耐热得物质失活,因此使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工降温、避免溶液内存在气泡,这样会使蛋白质变性【６】。
(5)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物得细胞壁、在每毫升含2亿个细胞得悬液中加1０0 g至1 mg溶菌酶,37℃保温１0 min,或者室温作用30 ｍｉｎ,细胞就破坏了、
洗涤包涵体
洗涤包涵体前先8000 r/rａin,412离心15 ｒaｉn,可使大多数包涵体沉淀,
与可溶性蛋白分离。
为了除去包涵体上粘附得杂质,如膜蛋白或核酸,利用洗涤液洗涤包涵体沉淀,常用去污剂Ｔriｔｏn x一100或脱氧胆酸钠与低浓度变性剂(如2moｌ/L尿素或盐酸胍等)洗涤以除去脂类,但过高浓度得尿素或盐酸胍会使包涵体溶解【。
溶解包涵体
包涵体一般只溶于强得变性剂如尿素、盐酸胍,它就是通过离子间得相互作用,打断包涵体蛋白质分子内与分子间得各种化学键,使多肽伸展,SDＳ、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内得疏水键,溶解一些包涵体蛋白质【8］。
另外,对于含有半胱氨酸得蛋白质,分离得包涵体中通常含有一些链间形成得二硫键与链内得非活性二硫键。
还需加入还原剂,如琉基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT),常用浓度2～1０ｍM。
另外,尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作用,所需浓度尿素6～8 Ｍ,盐酸胍5~7 M、一般来讲,盐酸胍溶解力强于尿素,它能使尿素不能溶解得包涵体溶解,但缺点就是容易使SDS—PAGE电泳条带变形【9]、尿素得溶解度为７O％～90％,其分解得异氰酸盐能导致多肽链得自由氨基甲酰化,特别就是在碱性pH值下长期保温时,但用尿素溶解具有不电离,呈中性,成本低,蛋白质复性后除去尿素不会造成大量蛋白质沉淀,以及溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化等优点,故目前已被广泛采用。
复性包涵体蛋白
由于包涵体中得重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈得处理条件,使蛋白得高级结构破坏,因此重组蛋白得复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性得完全伸展状态恢复到正常得折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形
成～1。
一般在尿素浓度4 Ｍ左右时复性开始,到2 M左右时结束。
对于盐酸胍而言,从4 M 开始,到1。
５M时复性过程结束。
包涵体蛋白得复性就是一个非常复杂得过程,除与控制蛋白质复性得过程相关外,还在很大程度上与蛋白质本身得性质有关,有些蛋白非常容易复性,在较宽松得条件下复性效率可以达到95％以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性得方法,很多蛋白得复性效率只有百分之几,一般说来,蛋白质得复性效率在２Ｏ%左右【l ２］。
复性中常采用得方法有以下几种:(1)稀释复性法,直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点就是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制【13)、(2)透析复性法,好处就是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模【1 。
(3)超滤复性,在生产中较多使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点就是不适合样品量较少得情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆地变性。
(4)柱上复性,就是最近研究较多并成功地在生产中应用得一种复性方法,常用于复性得层析方法有疏水层析(HIC)法、亲与层析(AFC)法等。