自 １９５９ 年 Ｋａｕｚｅｗａｎｍ 首 次 提 出 “疏 水 作 用 ”以 来， 人们采取多种手段及方法研究疏水作用与蛋白 质 折 叠 之 间 的 关 系 。由 于 生 物 体 内 的 蛋 白 质 处 于 水 相环境中， 蛋白质亲水基团暴露在外侧， 而疏水基 团出于避开水的需要而被迫接近被包埋的蛋白质 立体结构内部。此时， 蛋白质结构可以看作为亲水 疏水作用之间的平衡。 ３．２ 复性技术及方法
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ Ｒ ｅｆｏｌｄｉｎｇ
１ 包涵体形成的原因
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时， 无论是 用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表 达体系， 都可形成包涵体。事实上， 内源性的蛋白 质， 如果表达水平过高， 也会聚集形成包涵体。因 此， 包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。 动 力 学 模 型 表 明 ［１］： 活 性 蛋 白 的 产 率 取 决 于 蛋 白 合 成 的 速 率 、蛋 白 折 叠 的 速 率 和 蛋 白 聚 集 的 速 率 。 在 高水平表达时， 新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白 正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。实验证 明， 硫氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌 株 ＡＤＡ４９４， ＡＤＡ４９４ （ ＤＥ３） 等 有 利 于 二 硫 键 在 细 胞 质内的形成［２］。重组 蛋白在大肠杆菌中 表达时， 缺乏 一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子， 如折叠 酶和分子伴侣等， 是包涵体形成的又一原因。包涵 体虽然由无活性的蛋白组成， 但包涵体形成对于重 组蛋白的生产也提供了几个优势： 包涵体具有高密 度， 易于分离纯化； 组蛋白以包涵体的形式存在有 效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降
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子。对于细胞周质内形成的包涵体， 则需采用原位 溶 解 的 方 法 ［５］。 各 种 溶 解 方 法 都 各 有 利 弊 ， 一 般 来 讲， 盐酸胍优于脲， 因为盐酸胍是较脲强的变性剂， 而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰 蛋 白 质 的 氨 基 或 巯 基［６］。
３ 包涵体蛋白的复性 ３．１ 复性机制
收稿日期： ２００７－０４－０９ 基金项目： 宁夏自然科学基金资助（ 项目号： ＮＺ０５０５） 作者简介： 罗惠霞（ １９７６－） ， 女， 分子生物与生物化学硕士研究生 通讯作者： 王玉炯， 男， 教授， Ｅ－ｍａｉｌ： ｗｙｊ＠ｎｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２００７ 年第 ５ 期
罗惠霞等： 包涵体蛋白复性的几种方法
剂 或 表 面 活 性 剂 ： 如 ＣＨＡＰｓ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、 磷 脂 、 ｌａｕｒｙｌａｍｌｔｏｓｉｄ、Ｓａｒｋｏｓｙｌ、磺 基 甜 菜 碱 （ ＮＤＳＢ） 等 对 蛋 白 质 复 性 有 促 进 作 用［９］。 使 用 去 垢 剂 和 表 面 活 性 剂 的一个不利之处是由于它们能与蛋白质结合或形 成胶束， 故很难将它们完全除去。（ ５） 单克隆抗体： 待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性， 但 仅 该 蛋 白 质 特 异 的 抗 体 具 有 明 显 的 助 折 叠 作 用 ［１０］。 研究发现， 特异性抗体可以与待折叠蛋白的远离蛋 白质活性中心的疏水区结合， 从而有效地阻止了无 活 性 聚 集 体 形 成 。（ ６） 分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 等 ： 这 类 蛋 白 质 主 要 包 括 硫 氧 还 蛋 白 、二 硫 键 异 构 酶 （ ＰＤＩ） 、肽 酰 脯 氨 酰 顺 反 异 构 酶 （ ＰＰＩ） 、分 子 伴 侣 、ＦＫ５０６ 结 合 蛋 白 等 。分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 等 不 仅 可 在 细 胞 内 调 节 蛋白质的折叠和聚集过程的平衡， 而且可在体外促 进 蛋 白 质 的 折 叠 复 性 。由 于 分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 在 蛋 白质折叠复性后要除去， 而这类蛋白质又十分昂 贵， 因此采用可回收利用的方法如固定化方法为 好 。（ ７） 人 工 伴 侣 ： 为 了 模 仿 分 子 伴 侣 ＧｒｏＥＬ ＧｒｏＥＳ 的 作 用 ， Ｒｏｚｅｍａ 和 Ｇｅｌｌｍａｎ［１１］将 变 性 蛋 白 质 首 先 加 入到含去垢剂的溶液中以防止聚集， 然后用环糊精 ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ 除 去 去 垢 剂 以 促 进 折 叠 复 性 ． 这 种 方 法 被 称 作 人 工 分 子 伴 侣 促 折 叠 技 术 。（ ８） 稀 释 复 性 ： 稀 释 变 性 蛋 白 质 溶 液 、降 低 变 性 剂 浓 度 ， 从 而 为 蛋 白 质 折 叠 创 造 适 宜 的 外 部 环 境 ， 是 一 种 最 简 单 、也 是 传统的蛋白质复性方法。蛋白质折叠为分子内反 应， 为一级反应过程， 而聚集体的生成为二级以上 的反应过程。所以， 低蛋白质浓度有利于获得较高 的 复 性 收 率 。因 此 ， 目 前 蛋 白 质 复 性 的 浓 度 均 较 低 。 尽管在低浓度条件下多数蛋白质可获得较高的复 性收率， 但是降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液 体 积 ， 给 后 续 的 分 离 纯 化 增 加 困 难 。因 此 ， 在 提 高 蛋 白质复性收率的同时必须设法增大蛋白质浓度。 （ ９） 复性色谱： 复性色谱作为蛋白质分离纯化的重 要手段， 色谱技术对蛋白质复性的作用近年来得到 了广泛的认识， 其中引人注目的有尺寸排阻色谱和 固 定 化 辅 助 因 子 色 谱 。 （ １０） 吸 附 复 性 法 ： 将 变 性 蛋 白质吸附到某种介质上可以有效地抑制蛋白质分 子间的非特异性相互作用， 从而提高蛋白质的复性 率 ． 肝 素 琼 脂 糖 层 析 法 、金 属 螯 和 层 析 法 等 是 实 现 吸 附 复 性 的 有 效 方 法 。 将 单 抗 、分 子 伴 侣 等 蛋 白 质
·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
包涵体蛋白复性的几种方法
Байду номын сангаас
罗惠霞 李敏 王玉炯
（ 宁 夏 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 银 川 ７５００２１）
摘 要： 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时， 通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组 蛋白， 经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠， 才能够得到生物活性蛋白。
（ １） 氧 化— —— 还 原 转 换 系 统 ： 如 蛋 白 质 含 有 二 硫键， 在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分 子 质 量 巯 基 试 剂 的 混 合 物 ， 如 谷 胱 甘 肽 、半 胱 氨 酸 、 半 胱 胺 等 。其 还 原 型 （ １～３ｍｍｏｌ／Ｌ） 与 氧 化 型 的 摩 尔 比 为 １： １ 到 １０： １［７］。这 样 的 氧 化 还 原 系 统 实 际 上 给 蛋 白 质 形 成 的 是 一 个 还 原 环 境 。正 确 形 成 的 二 硫 键 在 这 样 的 环 境 中 还 是 有 可 能 被 还 原 的 。针 对 这 种 情 况， 还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤， 即加 入 过 量 的 氧 化 型 巯 基 试 剂 或 采 用 Ｃｕ２＋诱 导 的 空 气 氧 化 ， 以 保 证 形 成 稳 定 的 二 硫 键 。（ ２） 小 分 子 质 量 添 加剂： 如盐酸胍或脲， 以及其他一些化合物如烷基 脲 、碳 酸 酰 胺 类 等 ， 在 非 变 性 浓 度 下 是 很 有 效 的 促 进 剂 。 蛋 白 质 的 辅 因 子 、配 基 或 底 物 亦 可 起 到 很 好 的 促 折 叠 作 用 ， 如 蛋 白 质 的 辅 因 子 Ｚｎ２＋或 Ｃｕ２＋可 以 稳定蛋白质的折叠中间体， 从而防止了蛋白质的聚 集 ， 加 入 浓 度 大 于 ０．４ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ 缓 冲 液 可 提 高 包 涵 体 蛋 白 质 的 折 叠 效 率 。（ ３） 聚 乙 二 醇 （ ＰＥＧ） ： Ｃｌｅｌａｎｄ 等 ［８］在 研 究 ＰＥＧ 对 包 涵 体 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 影 响 中 发 现 ， ＰＥＧ 的 存 在 能 减 少 一 些 蛋 白 质 的 聚 集 。 蛋 白质的折叠通过一疏水融球态中间体， 这种中间体 的 聚 集 将 导 致 蛋 白 质 回 收 率 的 降 低 。ＰＥＧ 通 过 与 中 间体特异地形成非聚集的复合物而阻止了疏水中 间 体 的 聚 集 。 所 有 的 折 叠 反 应 在 ＰＥＧ 存 在 下 具 有 相 同 的 速 率 ， 复 性 率 与 ＰＥＧ 的 分 子 质 量 及 浓 度 相 。 （ ４） 非离子型去垢剂尤其是离子型或两性离子去垢
关键词： 包涵体 复性
Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ
Ｌｕｏ Ｈｕｉｘｉａ Ｌｉ Ｍｉｎ Ｗａｎｇ Ｙｕｊｏｎｇ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１）
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｗｈｅｎ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｇｅｎｅｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ （ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ） ｗｉｌｌ ｂｅ ｆｏｒｍｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｍｕｃｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｌｌ ｂｅ ｇｏｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ．
解； 对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒 害的蛋白时， 包涵体形成无疑是最佳选择。
２ 包涵体的分离及溶解
包涵体是聚集的蛋白质形成的非常致密的颗 粒 ， 它 们 可 直 接 用 反 相 显 微 镜 在 活 细 胞 中 观 察 到［３］。 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集 的重组菌细胞进行破碎， 所采用的破碎技术包括高 压 匀 浆 、超 声 波 破 碎 等 ， 为 了 提 高 破 碎 率 ， 可 以 加 入 一定量的溶菌酶。包涵体高度抗剪切力， 用以上破 碎 法 破 碎 后 仍 可 保 持 完 整 的 结 构 。离 心 除 去 破 碎 上 清液后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和 盐 酸 胍 、去 垢 剂 如 ＴｒｉｔｏｎＸ１００、脱 氧 胆 酸 钠 等 化 合 物 的 缓 冲 液 进 行 洗 涤［４］。 包 涵 体 的 溶 解 一 般 都 用 强 的 变 性 剂 如 脲 、盐 酸 胍 或 硫 氰 酸 盐 ， 或 去 垢 剂 如 ＳＤＳ、 正 十 六 烷 基 三 甲 基 铵 氯 化 物 、对 于 含 有 半 胱 氨 酸 的 蛋 白 质 ， 还 需 加 入 还 原 剂 如 巯 基 乙 醇 、二 硫 赤 藓 糖 醇 和 半 胱 氨 酸 。 温 度 一 般 选 择 在 ３０℃以 促 进 溶 解 。 此外， 由于金属离子具有氧化催化作用， 还常常需 要 加 入 金 属 螯 合 剂 如 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ 以 除 去 金 属 离