我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。
再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。
所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。
至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。
如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。
TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
046 wrote:
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
先过柱後复性。
蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
溶液装在透析袋中，然后覆盖上一些PEG，10～30分钟，根据个体情况而定。
蛋白质的保存，当然最好的是冻干保存，但是如果放置时间不会太长，比如不会超过半年，
完全可以放在-80度保存。
包涵体能放置多久？这个问题不知道，包涵体又不是成品蛋白，放置那么久没什么用。
046 wrote:
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
要用TGE反复透析，一般8小时左右换一次透析液，透析三次左右。
PH值要调，一般透析液的PH值要根据等电点来确定。
最好距离等电点稍微远点，否则极易产生沉淀。
2.不知你的0 M尿素缓冲液中是否有NaCl等盐类，一些蛋白遇盐易沉淀！解决方法去掉一些盐类成分。
如将PBS改成PB，将其中的NaCl及KCl去掉，改为只含有两种磷酸盐的环境！此其一！
另外，蛋白复性时，如果本身折叠的不好，在最后变性剂从有到无时也是容易析出的。
所以前期一定要保证复性环境平缓，不能太剧烈。
可适当加入一些小分子物质（如L-Arg），或加入氧化还原体系等。
我的缓冲体系是50 mMTris,5% 甘油，1 mMEDTA,pH值7.9
措施：提高pH值为10，尝试稀释复性
3. 1. 沉淀出现的问题可以多看看文献，都有解释。
楼上正解，水化层和电荷问题很大。
2. 更关键的，复性是正确构象形成过程，中间熔球态疏水区外展，疏水聚沉
3. 现在都通过添加外源物起到辅助复性，这个说法有待商榷，应该叫做提高复性效率，毕竟要辅助复性，分子伴侣可能是必需的
4. 有沉淀可能并不是坏事。
最可悲的是“复性”后蛋白都是可溶的，但没有相应的生物活性。
这个“复性”是假象，可溶并不一定是复性成功，SDS-PAGE检测不出来而已。
5. 复性问题是个大坑，不太陷得太深，见好就收。
4.酶活测定
1. 2×反应基质（A液）：2ml Triton X-100，0.5g阿拉伯胶溶于450ml缓冲液。
2. 对硝基苯丁酸酯溶液（p-NPB）：3mg/ml,用异丙醇溶解。
3. 不同pH的缓冲液：其中3.0~6.0 用50mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；7.0,8.0 用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；9.0~11.0用50 mmol/L Gly-NaOH缓冲液。
反应采用1 ml体系：取350 μl ddH2O、500 μl A液和100 μl底物(p-NPB)在一定温度下恒温水浴温育5 min，然后加入50µl待测酶液，在该温度下恒温反应10min，加入1ml 95%乙醇终止反应，测定A410。
4.透析
(2)透析复性液的配置
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融合蛋白的复性及功能检测
复性液I:100mmol/LTris一HCI(pHS.O)!0.15mol几NaCI!1mmol/LED认!6mol/L 尿素
复性液n:复性液卜0.5mol/LL一Arg
复性液111:复性液I+0.1mmol/LGSSG/0.5mmol/LGSH
复性液1V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGssG/0.5mmol/LGsH
复性液V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGsSG/o.smmol几GsH+Zmmol/L CaC12
步骤：
(l)取保存在-20e冰箱中的纯化蛋白,加入DTT至终浓度为25mmol/L,
室温孵育2h"
(2)用含有8mol/L的尿素的Elutionbuffe:将蛋白稀释至所需浓度,取变性
蛋白2ml分别加入透析袋中开始透析
(3)将透析袋置于100mL透析液中,4OC透析复性,每3h换一次透析液,
共换5次,通过缓慢降低透析外液中的尿素浓度(4mol/L一2mol/L),最后将透析
外液换为PBS液,更换2次,共透析巧ho
(4)透析完毕,取出溶液,4度下,1200Orpm,离心30min,吸取上清,将
上清置于-40度冰箱中备用"
(5)采用考马斯亮蓝法测定上清中复性蛋白的含量,计算复性产率"
硕士论文：中介蝮(Gloudius diusintermedius)神经毒素磷脂酶A2原核表达包涵体的复性及低温可溶表达研究。