Ni2+
15
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
3:
洗脱GST 融合蛋白
kD
94 67 43 30 20.1 14.4
12 3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化
系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品) 立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
6
GST MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
GSTrap™ 1 ml
10 - 12 mg
GSTrap 5 ml
50 - 60 mg
Glutathione Sepharose™ 4B 8 mg / ml
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
10 -12 mg / ml
注意
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
13
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒
• 快速酶测定 • 每块板可检测 50 样品 • 适合筛选表达系统和层析组
份
14
(His)6 融合蛋白的纯化和检测
Ni2+ Ni2+
重组蛋白 His His His His His His
Ni2+
80
fusion
protein
60
40
20
0
0
5.0
10.0
15.0
20.0
ml
5.0
10.0
15.0
20.0
min
10
SDS PAGE analysis
1:
低分子量标记 (LMW) Calibration kit,
还原, Amersham Pharmacia Biotech
2:
胞浆萃取液, 1 g /10 ml
检测方法
使用抗-GST 抗体和 ECL™ 检测系统的 免疫印迹法
注意
高度特异, 只检测 GST 融合蛋白 使用适当浓度的二级HRP标记抗体可以 使背景大大减低，甚至去掉 ECL 检测系统提高免疫印迹的检测能力 ECL 提供大部分重组表达应用所需的灵敏 度 需要更高灵敏度时使用 ECL Plus.
SDS-PAGE ＋Coomassie™ 考马氏染色或银染
层析分离纯化技术
2001.11.28 Shanghai Pudong
1
整体概述
概况一
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概况二
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概况三
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蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
4 CV结合缓冲液, 8 ml 样品, 10 CV结合缓冲液, 5 CV洗脱缓冲液, 5 CV结合缓冲液(CV = 柱体积)
ÄKTA™explorer 10
Elution buffer
% Elution buffer
3.0 2.5
Wash
2.0 1.5 1.0 0.5
100
2.7 mg
pure GST
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
3
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
简易纯化选择
载体和标记
pGEX 谷胱甘肽 S-转移酶
PQE 6 x 组氨酸
pET 6 x组氨酸
pEZZ 18 (非诱导性表达) 蛋白 A 的 IgG 结合区
pRIT2T (利用温度改变诱导) 蛋白 A 的 IgG 结合区
纯化
GST MicroSpin™ Purification Module, GSTrap™, Glutathione Sepharose™ Fast Flow
His MicroSpin Purification Module HisTrap™, HiTrap™ Chelating, Chelating Sepharose Fast Flow
IgG Sepharose 6 Fast Flow
IgG Sepharose 6 Fast Flow
4
GST 融合蛋白的纯化
11
GST 融合蛋白的检测
检测方法
GST 96 孔板 ELISA 检测试剂盒
GST 酶测定检测模组 功能测定
注意
适合筛选表达系统和层析组份 当表达蛋白的含量不明或需要高灵敏度 时特别用
快速测定；适合筛选用途 可以有效评估纯化出来的 GST 融合蛋白 的活性，但可能需要自行设计和优化
12
GST融合蛋白的检测
8
GSTrap™
结合缓冲液平衡 加样后用结合缓冲液冲洗 用洗脱缓冲液洗脱
3 min 废液
5-15 min 收集
9
2 min 收集组份
GSTrap™
柱: 样品: 结合缓冲液: 洗脱缓冲液 流速: 层析 步骤:
系统:
A 280
3.5
GSTrap 1 ml 8 ml 大肠杆菌表达含 GST 融合蛋白胞浆萃取液 PBS, pH 7.3 50 mM Tris™-HCl, pH 8.0 ＋ 10 mM 还原谷胱甘肽 1 ml/min
Glutathione Sepharose™
Mr 26 000
GST
重组蛋白
10C
酶切位点
Factor Xa:
Mr 17-20 000 / 28-30 000
Thrombin:
Mr 37 000
PreScission™ Protease:
Mr 46 000
5
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
GST MicroSpin™ Purification Module
适合蛋白质扩增系统筛选和优化，小规模纯化
• 立即可用, 50 预装柱含缓冲 液和所需试剂
• 可纯化每柱 400 µg, 体积达 400 µl 样品
7
GSTrap™ 柱
适合快速和重复性高的要求
• 20 分钟内 • 每 1 ml 柱 12 mg 或 每 5 ml 柱 60 mg • 使用针筒，蠕动泵，或者 ÄKTA™ 系统 • 添加剂兼容