919还原型谷胱甘肽的稳定性研究朱义福（星湖生物科技股份有限公司，广东肇庆 526040）摘要：本文研究了pH 、温度、光照以及外加抗氧化剂等因素对还原型谷胱甘肽(GSH)纯品溶液稳定性的影响。

结果表明，GSH 水溶液在pH=2.0~4.0范围内最为稳定；在30 ℃以下，24 h 内自身氧化较少；应避光处理或保存；外加抗氧化剂在pH=6.0时，保护作用明显。

关键词：谷胱甘肽；稳定性；抗氧化剂 文章篇号：1673-9078(2011)8-919-923Stability of Reduced Glutathione under Different ConditionsZHU Yi-fu(Star Lake Bioscience Co., Inc., Zhaoqing 526040, China)Abstract: The effects of pH, temperature, sunlight and antioxidant on the stability of reduced glutathione (GSH) solution were studied in this paper. Results indicated that GSH solution was relative stabile under the following conditions: pH 2.0~4.0 and temperature <30℃. And it should be kept in dark place. Besides, the GSH solution showed the highest stability in the presence of antioxidant at pH 6.0.Key words: glutathione; stability; antioxidant谷胱甘肽（Glutathione ，GSH ），即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性三肽化合物。

GSH 是许多酶反应的辅基，在生物体内具有清除体内自由基、解毒等多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境具有重要意义[1]。

国内外关于GSH 的研究主要集中在菌种选育[2]、培养条件优化[3]、分离纯化[4]和临床应用上[5]，其工业化生产技术一直被国外极少数发达国家所垄断，国内尚未实现工业化生产，从而造成GSH 的市场价格居高不下，影响了GSH 的推广和应用。

GSH 易溶于水、稀醇、液氨和N,N-2甲基甲酰胺，而微溶于或不溶于醇、醚和酮。

GSH 的固体较稳定，而水溶液在外界环境中受温度、pH 、光照等条件影响，易氧化，产生氧化型谷胱甘肽（即GSSG ），GSSG 是由两分子GSH 脱氢后通过二硫键相连的二聚体，其反应如下：氧化型GSSG 不具有生理活性，只有还原型GSH 才能发挥重要的生理功能。

GSH 的不稳定性是造成较难分离纯化、产品纯度不高的重要原因。

因此，本文通过大量的试验对GSH 稳定性进行研究，为国内GSH 的工业化生产提供参考。

收稿日期：2011-03-26作者简介：朱义福（1976-），男，工程师，研究方向：生物医药分离纯化技术1 材料与方法1.1 材料与试剂GSH 纯品（纯度>98%）：日本Kyowa 公司。

四氧嘧啶（Alloxan ）：美国sigma ； 二硫苏糖醇（DTT ）：上海生工所；抗坏血酸（Vc ）：广州化学试验厂；保险粉（Na 2S 2O 4）：上海国药集团化学试剂公司；其它试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器SC-15数控超级恒温槽：宁波新芝生物科技公司；CR21G 高速冷冻离心机：日本Hitachi 公司；752型紫外可见光分光光度计：南京第四分析仪器公司；S40 pH 精密测量仪，AB54-S 分析天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司；RW20D 搅拌器：德国IKA 公司；Agilent LC1100液相色谱仪：美国HP 公司。

1.3 分析方法GSH 含量测定采用四氧嘧啶Alloxan 试剂法 [6]：（1）标准曲线的制作：准确称取6.146 mg 的GSH 标准品，用40%乙醇溶解，定容至100 mL ，得到浓度为200 µmol/L 的标准液。

取0 mL 、0.2 mL 、0.4 mL 、0.6 mL 、0.8 mL 、1.0 mL 上述标准液于试管中，补加去离子水至1.0 mL ，配成浓度为0 µmol/L 、40 µmol/L 、80 µmol/L 、120 µmol/L 、160 µmol/L 、200 µmol/L 的GSH 溶液。

然后依次加入pH 7.6的磷酸缓冲液2.5 mL ，0.1 mol/L 的甘氨酸溶液0.5 mL ，以及Alloxan 试剂1.0 mL ，反应20min。

以空白管校正零点，于305 nm处测定吸光值A，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作GSH标准曲线；（2）GSH含量的测定：取2支试管，分别加入3.5 mL磷酸缓冲液和0.5 mL甘氨酸溶液，2支试管中分别加入1 mL 待测液，然后一支试管中加入1 mL去离子水，另一支试管中加入1 mL Alloxan试剂，反应20 min，以前者为空白，于305 nm处测定吸光值A，根据A值即可以从标准曲线上查得样品GSH的浓度。

GSH纯度测定采用高效液相色谱法[7]，并经本实验室改进：色谱柱：Agilent C18-HC (150 mm×4.6 mm×5 µm)；流动相：磷酸盐缓冲溶液与甲醇以体积比95:5混合；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温箱：30 ℃。

1.4 试验方法GSH纯品溶液制备：用分析天平准确称取纯品GSH，用纯净水溶解，用容量瓶定容，准确配制成含量为5 g/L GSH的水溶解，避光冷藏保存。

温度对GSH稳定性试验：选取工业生产中常见的三种不同浓缩操作温度：30 ℃、45 ℃、60 ℃作为考查点，将新鲜配制的GSH纯品溶液用5 N HCl或5 M NaOH调pH=3.0，各取50 mL分装到带塞的棕色玻璃三角瓶中，同时放入不同设定温度的恒温水浴槽中，开始计时，在预定时间分别取样测定不同温度的GSH溶液的含量。

pH值对GSH稳定性试验：将新鲜配制的GSH纯品溶液各取50 mL分装到带塞的棕色玻璃三角瓶中，分别用5 N HCl或5 M NaOH调至给定pH值；在室温（25 ℃~30 ℃）条件下，敞口放入水浴振荡器中以50 r/min轻微晃动，开始计时，于不同时间分别取样测定不同pH值的GSH溶液的含量。

光照对GSH稳定性试验：将新鲜配制的GSH纯品溶液用5 N HCl或5 M NaOH调pH=3.0，各取50 mL分装到带塞的无色和棕色玻璃容量瓶中，置于光橱内（4500±500lx），室温（25 ℃~30 ℃）照射24 h，在预定时间分别取样测定其含量。

抗氧化剂对GSH稳定性试验：选取三种常用的抗氧化剂二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸（Vc）、保险粉(Na2S2O4)，取新鲜配制的GSH纯品溶液各50 mL，分别用5 N HCl或5 M NaOH调pH值至1.0、3.0和6.0，分别加入浓度0.1 wt.%的抗氧化剂、混匀后分装到带塞三角瓶中，并置于预设不同温度的恒温水浴槽中，于不同时间点取样，测定其含量。

2 结果与讨论GSH是一种具有生物活性的三肽化合物，其结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，具有还原作用，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂，保护细胞内含巯基酶的活性。

防止GSH分子间的-SH形成二硫键，阻止产生没有生物活性的GSSG，在微生物发酵法制备GSH的分离纯化工艺过程中，保持GSH的稳定性是工业化大生产的前提和研究方向。

2.1 GSH标准曲线的测定采用Alloxan法测定得到的标准曲线见图1，回归方程为：y=399.15x+0.5448，相关系数R2=0.9999。

图1 GSH标准曲线Fig.1 Calibration curve of GSH2.2 温度对GSH稳定性的影响避光、pH=3.0条件下，温度对GSH稳定性的影响的实验结果见表1。

由表1可知，当温度超过室温时，GSH含量随时间的增加而明显减少，温度越高，下降趋势越明显。

温度为30 ℃时，GSH水溶液避光保存72 h 后其检测量仍可稳定在90%以上；温度为45 ℃时，24 h 内，GSH纯品含量下降了10%；温度为60 ℃时，24 h 内，GSH纯品含量下降了80%以上。

可见，低温有利于GSH自身稳定性，在30 ℃以下工业化操作处理，才能保证纯化手段达到预期的效果。

表1 温度对GSH稳定性（残存率/%）的影响Table 1 The effect of temperature on the stability of GSH solution 温度/℃取样时间/h0 6 12 24 48 7230 100 100 99.6 98.6 91.290.245 10098.494.9 87.0 70.462.760 10079.138.5 16.8 3.0 0.1 2.3 pH值对GSH稳定性的影响pH值影响着溶液中各物质的带电性质，两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当外界溶液的pH 大于两性离子的pH值，两性离子释放质子带负电。

当外界溶液的pH小于两性离子的pH值，两性离子质子化带正电。

当两性离子正负电荷数值相等时，溶液的pH 值即其等电点pI (isoelectric point)。

pI是氨基酸和多肽类物质的重要特征参数，GSH的带电性质与pI有关，对920于GSH的等电点这一特征性参数，一些文献资料的报道相差较大，有的文献报道的是5.96[8]，而另一些文献则是2.83[9]，是通过不同的方法计算出来的。

GSH在溶液中存在复杂的解离平衡：GSH+=GSH±+H+，pK1(COOH)=2.12GSH±=GSH-+H+，pK2(COOH)=3.59GSH-= GSH2-+H+，pK(NH3+)=8.75GSH2-=GSH3-+H+，pK(SH)=9.65GSH±是等电pH时的主要存在形式，以理论近似计算：pI=[pK1(COOH)+pK2(COOH)]/2=2.86而根据Handerson-Hasselbalch公式：pH=pK++lg[质子受体]/[质子供体]，以及所给的pKa等数据，可以推算出在一定pH条件下各种离子的解离分离率（见图2）。