蛋白质组学研究路线
主要技术
1. 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2DE）
第一向：等电聚焦（IEF），根据蛋白质的等电点进行分离 第二向：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量差异 进行分离
2.双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）
Schematic showing the top-down and bottom-up approaches to protein analysis and identification. In the top-down approach, the intact protein is fragmented in the gas-phase to create sequence-specific fragment ions to aid in sequence analysis. The bottom-up approach uses proteolytic enzymes to create peptides for sequence analysis usually by using multidimensional liquid chromagoraphy in combination with tandem mass spectrometry
傅里叶变换离子回旋质谱的电子捕获解离技术鉴定肽片段的磷酸化位点
4.蛋白质的相互作用
首先通过生化的方法纯化蛋白质复合体，然后用质谱分析 其组分 用质谱技术研究此类问题主要有两种策略，一是分离获得 结合蛋白，再用SDS-PAGE分离，并进行胶内酶切与串联 质谱分析；或将混合蛋白质直接酶解，用多位色谱串联质 谱进行鉴定
DART(direct analysis in real time)
MALDI
使用基质的目的是为了保 护待分析物不会因过强的 激光能量导致化合物被破 坏 使用特定波长的激光（常 用337nm和355nm紫外激 光、1.06μ m红外激光等） 照射到样品靶上，样品靶 上的基质将吸收到的能量 传递给样品，使样品产生 瞬间膨胀相变而发生本体 解吸，使样品离子化
基本原理：通过对被测样品离子的质核比的测定来进行分 析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利 用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质 荷比（m/z）分开而得到质量图谱，通过样品的质量图谱 和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。
质谱技术的发展
1912 英国物理学家 Thomson研制成功第一台质谱仪 20世纪20年代 质谱成为一种分析手段被化学家所采用 40年代开始 质谱广泛用于有机物质的分析 1966 Munson&Field报道了化学电离源，质谱第一次可以 检测热不稳定的生物分子 80年代 随着软电离技术（快原子轰击FAB、电喷雾ESI、 基质辅助激光解吸MALDI）的发展，生物质谱得到了飞 速发展
采用专有的荧光染料与多重 样本和图像分析的方法，在 同一块胶上可同时分离多个 有不同荧光标记的样品，并 以荧光标记的样品混合物为 内标，对每个蛋白质样品和 每个差异都可以进行统计学 可信度分析
生物质谱技术
质谱是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列 的图像
质谱仪是一类能使物质离子化并通过适当的电场、磁场将 它们按空间位置、时间先后或轨道稳定与否实现质量比分 离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分 析系统、电学系统和真空系统组成
蛋白质鉴定流程
酶解
样品
PMF 肽指纹图谱 序列数据库
酶解片断
一级质谱
PSMs及后筛选 成功鉴定
对库 检索
串联质谱
未知蛋白
De-novo 序列分析
定性蛋白组学实验平台
2.蛋白质的定量分析
定量蛋白质组学:把一个基因组表达的全部蛋白质或一个 复杂体系中的所有蛋白质进行精确地定量和鉴定 原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽可以通过 比较质谱峰的强度或峰面积得到待比较蛋白质的相对量
常规的MALDI源处在真空系统内，不允许MALDI-MS直 接在线和其他样品预分离系统联用，也无法直接和其他自 动化、机器人处理系统联用，不可避免影响整个MALDIMS样品检测的高通量性
APMALDI(Atmosphere Pressure)
SELDI(Surface Enhanced
TOF
离子在离子源里产生，在电压为V 的电场作用下加速，飞过漂移区后 到达检测器内，这段飞行时间为其 在加速区中飞行时间和漂移区的飞 行时间之和，正比于其质量的平方 根
方法
1.直接进行比较，包括SDS-PAGE、2DE、HPLC;
2.标记方法，包括同位素标记亲和标签（ICAT、 iTRAQ）、元素标记亲和标签（ECAT）、酶促18O标记、 DYGE技术和同位素氨基酸细胞培养标记（SILAC)
例：iTRQA试剂结合生物质谱用于蛋白质组的相对定量方法
(1)试剂的反应基团（PRG） 特异地与肽段的N-端氨基和 Lys的ε-氨基结合； (2)平衡基团与不同质量的报 告基团在一级质谱图上显示为 一个峰，为肽段质量数加上 144 Da； (3) 在二级质谱图上，报告基 团特异性地断裂，其比值即为 两样本中蛋白的相对定量
根据研究目的，蛋白质组学可分为 表达蛋白质组学 (expression proteomics）
结构蛋白质组学 (structure proteomics)
功能蛋白质组学 (functional proteomics)
1.表达蛋白质组学 研究细胞或组织中蛋白质表达的质和量的变化，以及不同 时间基因表达谱的改变 2.结构蛋白质组学 以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊细胞器中的 蛋白为研究目的，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并 解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用 3.功能蛋白质组学 研究在不同生理和病理条件下，细胞中各种蛋白质之间的 相互作用关系及其调控网络，以及蛋白质的转录和修饰
DESI(desorption electrospray ionization)
该技术的突破在于可以直接在大气压环境下分析未经任何 处理的样品，如皮肤、花朵、尿液、生理组织等
DESI直接将电喷雾的带点液滴和溶剂离子射向被分析物 表面，就可以使样品表面的分子解吸附并带上电荷被质谱 检测。Cooks课题组曾使用DESI技术直接分析人肝腺癌 组织样品，成功找到一些特殊磷脂在癌变区域含量异常升 高的现象，而这些磷脂的存在正是和人体器官内机能紊乱 神经酰胺引导的细胞死亡通路相关联
ElectroSpray Ionization(ESI) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization(M Flight(TOF) Ion Trap(IT) Quadra poles(Q) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance(FT-ICR)
01
02
IT
离子阱的上下端罩与左右环电极构
成可变电场，带电离子在一定轨道 上旋转，改变电压可使相同m/z离 子依次离开进入电子倍增器而分离
Q
样品离子沿电极间轴向进入电场后， 在极性相反的电极间振荡，只有质 荷比在某个范围的离子才能通过四 级杆到达检测器，其余离子因振幅 过大与电极碰撞，放点中和后被抽 走
生物质谱的一般结构
质谱仪组成
检测 电离
质量分选(过滤)
离子源
形成离子 (带电分子)
质量分析器
根据m/z分选离子
离子检测器
检测离子
样品
基本步骤: 1. 样品离子化 2. 根据质量(m/z)不同分离离子 3. 检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图
数据处理
质谱
生物质谱仪的离子源与质量分析器 离子源
5.检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输 出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论 数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白
现在生物质谱主要在蛋白质组学研究中承担以下任务：
（1）通过精准的质量分析器来测定蛋白质的准确分子量或检测肽指 纹谱 （2）通过CID、CAD、PSD等串级方式对肽段进行序列测定 （3）对蛋白质巯基及二硫键进行定位 （4）对蛋白质翻译后修饰状况进行定位 （5）检测生物分子相互作用及非共价化合物
电喷雾离子化仅能容忍较低容量的缓冲溶液、盐和表面活 性剂，这些物质可以和分析物形成化合物从而干扰分子量 的测定或抑制分析物离子的形成。HPLC是分离去除污染 物的常用手段，而ESI的一大优点就是可以很容易的和 HPLC等各种预分离技术相连接。随着20世纪90年代，纳 喷雾的出现，ESI-MS灵敏度大大提高，已经可以检测 Femtomole(毫微微克分子)和Attomole(10-18 mole)级 的生化样品
ESI
借助强电场使电子分离，当样品溶液以低流速经毛细管流出后，在雾 化器的辅助下雾化成细小的带点液滴。这些液滴在运动过程中逐渐脱 溶剂化导致体积变小，表面电荷密度增大，当达到一定极限时，液滴 发生爆裂产生更小的液滴。如此不断重复，直至液滴很小时，由于液 滴表面电荷密度极大，足以从液滴中解析出分子离子，而后者最终进 入质谱分析器
1.基质与多肽样本共同 置于刚靶上 3.多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取 决于多肽离子的M/Z的大小
20 - 25 kV
Flight tube
High vacuum
High voltage
2.样本被激光电离形成多肽 离子混合物
Tim e
Pulsed laser
4.到达检测器的离 子，通过检测器检 测出每个肽段离子 的M/Z
3.蛋白质的翻译后加工
蛋白质的修饰类型主要有磷酸化、糖基化等，其中蛋白质 的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。蛋 白质磷酸化是增加了HPO3基团，可通过增加80u的氨基 酸残基质量数来检测，便可识别蛋白质翻译后修饰信息