3.2 Thermo蛋白质组学解决方案——目标蛋白质 定量
发现生物标记物
Slow, lower-throughput High-resolution, information-rich data
Sample Preparation
Patient Samples
LC-MS/MS
LC-MS/MS Intelligent SRM
1.1 蛋白质组学基本概念
蛋白质组 • 基因组表达的所有蛋白质，即一种细 蛋胞白、质组织学或生物体所拥有的全部蛋白 • 质以一种细胞、组织或生物体所拥有的
全部蛋白质为研究对象的学科
1.2 蛋白质组学的分类和研究对象
➢ 表达蛋白质组学
• 采用高通量的蛋白质组学研究技术分析细胞、组织和生 物体内尽可能多乃至于接近所有的蛋白质，对这些蛋白 质进行分离、识别、定量、定位，从而构建某个细胞、 组织或生物体全蛋白质的表达谱
1460.4
y
+1 9
1180.5
b
+1 13
25
1067.5
1389.3
20
y
+1 7
b
+1 10
y
+1 11
821.4
1014.3
1251.6
15
b
+1 6
10
y
+2 8
616.2
484.2
5
b
+2 6
y
+1 3
b
+1 5
308.2 410.3 501.3
0
y
+2 16
b
+1 9
901.5
883.2
Align Frame Identify
得到结果：
• 特征鉴定 • 半定量信息 • 具有统计学意义 • 提供趋势变化信息
适用于：肽段，蛋白质，小分子
3.2.1.4 生物标记物的发现
例子：谱图保留时间校正
Before alignment
After alignment
3.2.1.4 生物标记物的发现
95 90 85 80 75 10070 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
1041.0171 z=2 1041.5186 z=2
1038.5087 1038.0074z=2
z=2
1039.0102 z=2
1039.5125 z=2
AEDNADTLALVFEAPNQEK*
酶解
蛋白质定量
肽段混合物 色谱分离
质谱鉴定
蛋白质软件
2.2 蛋白质组学的研究方法
蛋白质 提取
蛋白质 分离
质谱 鉴定
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——酶 解
Trypsin 胰蛋白酶
Mass determination of the resulting peptides： Peptide Mass Fingerprint
质谱在蛋白质组学中的应用
• 蛋主白要质内组容学基本概念、分类和研究对象
• 应用于蛋白质组学的生物质谱技术 • 各类蛋白质组学研究方法 • Thermo蛋白质组学全面解决方案简介
1. 蛋白质组学基础
1.1 蛋白质组学基本概念
什么是蛋白质？
1.1 蛋白质组学基本概念
蛋白质是一切生命的物质基础，是生命活动的主要承担者
3.2.1 相对定量
3.2.1.1 体外同位素标记
• 一系列具有相同化学结构的用同位素标记的MS/MS标签，可 与氨基发生反应
Tandem Mass Tags - TMT
Thompson, A., et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 2003, 75(8), 1895-1904. Dayon, L., et al. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plex isobaric tags. Anal. Chem. 2008, 80(8), 2921 -2931.
蛋白质检测
电泳& 染色 免疫检测 蛋白质测定
样品制备
细胞裂解 透析和除盐 质谱前样品处理
免疫检测
Affinity bioreagents Endogen
Pathway tools 二级抗体
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
Thermo Scientific 生物质谱系列
蛋白质发现和鉴定
蛋白质组学软件
3.1 蛋白质的高通量分离和鉴定
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
样品制备
LC-MS/MS 分离鉴定
The Most Successful Labs and Companies
软件分析
3.1 Thermo蛋白质组学解决方案
蛋白质功能
亲和纯化 抗体
蛋白质表达 蛋白质相互作用
蛋白质修饰 蛋白质结构
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂 解
MS
MS/MS
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂 解
➢CID、ECD、ETD裂解方式示意图
➢多肽串级质谱碎片离子示意图
2.3 生物质谱解析蛋白质组学基本流程——裂
解
R 1
H HO
R 3
HH
肽Hale Waihona Puke ： H 2 N C C N C C N C C N C C O O H
3.2.1.1 体外同位素标记
TMT标记用于蛋白质相对定量
3.2.1.1 体外同位素标记
定量信息
肽段的氨基酸序列信息
3.2.1.2 体内同位素标记
SILAC技术用于蛋白质相对定量
Ligh:t Heavy 1H : 2H 12C : 13C 14N : 15N 16O : 18O
Relative Abundance Relative Abundance
➢ 功能蛋白质组学
• 以某种特定细胞、组织或生物体为对象，研究蛋白质的 翻译后修饰、蛋白质结构、蛋白质的定位及表达水平差 异与功能之间的关系，研究蛋白质之间的相互作用及其 意义，构建蛋白质功能网络
➢ 结构蛋白质组学 ➢ 生物信息学
1.3 蛋白质组学的应用和发展趋势
➢ 研究对象：
• 原核微生物、真核微生物、植物和动物等
3.2 生物质谱应用于定量蛋白质组学
• 非标记相对定量：峰面积 • 同位素标记相对定量
ICAT： Isotope-coded affinity tag ( ICAT) 同位素代码标记技术应用一种含与蛋白质反应基 团、乙烯甘油结合区和生物素标记的试剂，这项技术目前主要由美国ABI公司推动。 目前, 商品化的ICAT试剂可专与蛋白质或肽段的L2半胱氨酸的巯基反应, 所带的同位素标记为含8 个氢原子的(d0) 轻试剂和8 个氘原子的( d8 ) 重试剂 （体外标记） iTRAQ： ABI公司推出的质谱定量方法,可以同时标记四个不同的样品(现在有最新的可同时 标记八个不同的样品的iTRAQ试剂)。其原理是使用非聚合同重标签标记肽段,该标签含有一 个报告基团(分子量分别为114 ,115 ,116 ,117)、一个平衡基团(分子量分别为31,30 ,29 ,28) 和一个肽反应基团,不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配,保证总分子量为145。肽反 应基团将iTRAQ标签与肽段的N-端基团和每个赖氨酸侧链相连,可标记所有酶解肽段（体外 标记） TMT：Thermo Fisher Scientific （体外标记） SILAC： 在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸，如赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu) 、苯丙氨酸(Phe)等，主要用于高等动物细胞中蛋白质的鉴定及定量（体内标记） • 绝对定量 ：峰面积定量（SRM、MRM、SIM）
• TMT
• SILAC
• iTRAQ
• Dimethylated SILAC
• ICPL
• ICPL
• O16/O18
3.2.1.4 非标记相对定量
SIEVE——无标记定量分析软件
State 1 raw file
State 2 raw file
State … raw file
SIEVE Workflow
Differential Expression Analysis
List of candidate biomarkers
为医疗诊断提供目标蛋 白质定量分析方法
Fast, high-throughput Sensitive, specific, targeted Robust, reproducible Cost-effective
• 分离：凝胶电泳、多维液相色谱、其它 • 鉴定：生物质谱
➢ 定量蛋白质组学
• 同位素标记：ICAT，ITRAQ，TMT，SILAC • 无标记：质谱峰面积，质谱数（Spectral Counts）
➢ 翻译后修饰蛋白质组学
• 磷酸化蛋白质分离及鉴定 • 糖基化蛋白质分离及鉴定 • 其它翻译后修饰
➢Top Down蛋白质组学
SIEVE的非标记（Lable Free）定量结果
• SEQUEST for protein/peptides • ChemSpider for small molecules
#6252-6252 RT:73.33-73.33 NL: 1.22E4 100