一．CARP质粒的扩增与测序
1.CARP带有Flag标记的质粒的扩增（plasmid 载体）
试剂配置
LB培养基配方1000 ml:
胰蛋白胨TRYPTONE 10 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 5 g
NaCl 10 g
加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH（200ul）调pH 到7.0,灭菌
LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml
胰蛋白胨TRYPTONE 2 g
酵母提取物YEAST EXTRACT 1 g
NaCl 2 g
Agarose 琼脂粉 3 g
加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH（40ul）调pH 到7.0,灭菌.
等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml(200ul)加入氨苄青霉素，混匀，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。
DH5α感受态细胞的制备
1、LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。
14-16h
2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇
3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。
4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。
5、弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
6．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
7．弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
8.200ul分装保存-20摄氏度（-4摄氏度）
CARP质粒转化大肠杆菌
1、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.
3、42℃水浴，2 min；室温，2 min
4、加上无选择性的LB培养基1 ml,37℃摇菌30 - 45 min
5、用200μl铺氨苄青霉素抗性的固体LB培养基性培养皿, 37℃过夜。
（常用的大肠杆菌有BL21和DH5a，前者是表达菌，主要用来表达蛋白，后者是克隆菌，主要用来扩增质粒）
2.将菌液送到公司测序
二．根据CARP的序列设计引物
1.设计引物（引物一端有质粒的酶切位点的基因）
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
2.引物与CARP质粒在PCR后得到含有引物的DNA片段，PCR产物纯化
1. DNA模版
2．对应目的基因的特异引物
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
引物1（10pM） 2 μl
引物2（10pM） 2 μl
Taq酶（2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
2．将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
电泳胶回收或者试剂盒回收
PCR产物纯化
1、加5倍体积的PB
2、将Spin柱放于2ml收集管上
3、加样液，14Krpm，离心1min
4、弃去排出液
5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
6、弃去排出液,14Krpm,离心1min
7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
2.DNA片段插入载体，构建重组质粒
双酶切
载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：载体10ul PCR产物20ul
10x buffer 3ul 10x buffer 3ul
100xBSA 0.3ul 100xBSA 0.3ul
酶1 1ul 酶1 1ul
酶2 1ul 酶2 1ul
H2O 14.7ul H2O 4.7ul
双酶切后的载体用试剂盒割胶回收
1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解
3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中
4.加样液，14Krpm，离心1min
5.弃去排出液
6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
7.弃去排出液,14Krpm,离心1min
8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
3.质粒转化BL-21菌中表达
连接
上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。
连接体系如下：
载体 2ul
PCR 片段 6ul
10x酶 buffer 1ul
连接酶DNA ligase 1ul
转化
取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。
将平板在37℃倒置培养过夜。
挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。
4.重组质粒表达产物
生出菌
枪头取菌 +10毫升培养液
摇菌13-14小时 250转 37℃
5.送到公司得单克隆抗体。