实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。

引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。

称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。

（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。

（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。

4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。

DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。

（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。

（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。

将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。

（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，弃滤液。

（5）将柱子装回收集管中，加入700μl SPW wash buffer，10000×g离心1min，弃滤液。

（6）重复步骤（5）一次。

（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。

13000×g离心2min，洗脱DNA。

1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。

质粒抽提采用OmegaBio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：1 取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。

划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm 培养12h。

2 加入200μl GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。

3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。

4 加入200μl Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。

5 往重悬液中加入200μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。

6 加入300μl Solution Ⅲ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。

室温下，10000×g离心10min。

7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。

室温下，10000×g离心1min，弃滤液。

8 将柱子装回收集管中，加入500μl HiBind buffer。

室温下，10000×g离心1min，弃滤液。

9 将柱子装回收集管中，加入700μl Wash Solution。

室温下，10000×g离心1min。

重复该步骤一次。

10 重复步骤9一次。

11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。

13000×g离心2mi。

跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。

-20℃冰箱中保存备用。

1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37℃水浴反应4h，反应体系如下：表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：表达载体15μl cofilin-1片段10μl92μl10×H Buffer 2μl 10×H Buffer（ＬＭＨＫＴ代表缓冲液中盐浓度或成分不同）XhoI 1μl XhoI 1μlNdeI 1μl NdeI 1μlddH2O 1μl ddH2O 6μlTotal 20μl Total 20μl1.4 酶切产物的回收酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。

步骤同PCR反应产物胶回收。

1.5 连接反应将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收产物于16℃连接24h，反应体系如下：cofilin-1 cDNA酶切回收产物18μlpET-28a酶切回收产物6μl10× T4 DNA ligase buffer 3μlT4连接酶3μlTotal 30μl1.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）1 于-20℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37℃恒温箱中培养过夜。

挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。

2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，180rpm，培养2-3h，当OD600=0.3~0.5时，停止摇菌。

3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min 左右。

4 4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。

5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。

6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80℃保存备用。

1.7 连接产物的转化1 将感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。

2 将16μl连接产物加入100μL感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。

3 将Eppendorf管放入42℃水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。

4 于EP管中加入400μl LB培养基，置于摇床上，37℃，50rpm培养45min。

5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20μg)，置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

1.8 双酶切鉴定重组子1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，37℃，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。

3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37℃水浴箱中水浴4h。

反应体系如下：质粒pET28a-cofilin-1 1μl10×H Buffer 1μlXhoI 1μlNdeI 1μlddH2O 6μlTotal 10μl4 电泳分析。

将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析1.8.2 重组子的序列分析挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃、180rpm过夜12h，15％甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。

并送样品英骏公司测序。

2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备具体方法和步骤同1.6。

2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。

于LB固体培养基（含卡那霉素20μg）上划平板，并筛选阳性单克隆。

2.3 cofilin-1的诱导表达挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养至OD600=0.8～1.0。

取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导β-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h。