不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割——PvuⅡ和HindⅢ对pUC19-P35S:ARF8双酶切费欢 1014100060广州大学生命科学学院生物科学2010级摘要为加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性和其专一性的认识，采用PvuⅡ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。

采用限制性内切酶PvuⅡ和HindⅢ共同对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。

结果获得6条带，大小分别为2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp。

关键词限制性核酸内切酶PvuⅡ和HindⅢ、质粒DNA、双酶切、琼脂糖凝胶电泳引言：限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它能将外来的DNA 切断，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA 却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。

限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶。

[1]其中Ⅰ型和Ⅲ型水解核酸要消耗ATP，它既特异性切割核酸又能给特殊碱基加上甲基基团进行修饰，但特异性弱，切割位点不固定; Ⅱ型水解核酸不需要消耗ATP，它只特异性切割核酸并不修饰碱基，其特异性强，切割位点固定。

[2]限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA 分子特异性核酸序列的DNA水解酶。

它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。

本实验可加深对限制性内切核酸酶切割质粒DNA的位点特异性的认识，通过实践充分了解PvuⅡ和HindⅢ两种酶双酶切质粒DNA产生的片段。

研究人员通过使用15种限制性内切酶酶切重组质粒pBKrsv-MLCK，探讨了限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法。

[3]近几年，各种动物体内线粒体DNA的酶切分析的研究十分广泛，并取得了一定的成果(宋平,李小迎,熊全沫,1994[4]；戴建华,殷文莉，2004 [5]；关海红,石连玉,刘明华等，2000 [6])，采用Tru 9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/Pst Ⅰ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究同样有所帮助（王荻,徐革锋,刘洋等，2009）[7]。

没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。

因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。

1.材料和方法1.1材料1.1.1实验材料重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实验室构建；限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司；琼脂糖：进口分装。

1.1.2实验设备水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，PCR热稳定仪，微波炉，凝胶成像系统等。

1.1.3试剂5 x TBE电泳缓冲液；无菌水；M缓冲液；10×loading buffer；溴化乙锭溶液母液：将EB配置成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温；DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

1.2方法1.2.1 DNA酶切反应1.2.1.1将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 10µl和M缓冲液2µl，再加入无菌水使总体积为19µl，将管内溶液混匀后加入酶液PvuⅡ和Hind Ⅲ各1µl，用微量离心机离心数秒使溶液混匀并集中在管底。

1.2.1.2混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上，37℃水浴保温3小时，使酶切反应完全。

1.2.1.3每管加入5µl10×loading buffer，混匀，以停止反应。

1.2.2 琼脂糖凝胶的制备1.2.2.1取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml，配置成0.5xTBE稀释缓冲液，待用。

1.2.2.2胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5xTBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。

加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。

加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

1.2.2.3胶板的制备：将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应于胶槽底面保持1mm左右的间隙。

向冷却至0-60℃的琼脂糖液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5μg/ml。

用移液枪吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。

倒胶时的温度不可太低，否则凝固部均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。

待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后想槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽总，所以要注意包装样品槽中应注满缓冲液。

1.2.3 电泳分离DNA片段1.2.3.1加样：用微量移液枪取13µl酶解液小心加入样品槽一上样孔，再取9.5µl酶解液加入另一上样孔。

上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

1.2.3.2电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。

控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，电泳28分钟。

1.2.3.3观察和拍照：在长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳胶板，DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。

2.结果和分析双酶切质粒DNA 电泳图谱观察0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17图1 限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ对质粒pUC19-P35S:ARF8的双酶切电泳图谱 （栏0：DNA Maker ; 栏2：本实验的酶切图谱）2.1 结果如图1所示，用限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，可以看出6条带图谱，通过与DNAMarker 进行比对，判断其片段大小由上至下分别为：2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp ，而理论上Pvu Ⅱ在质粒DNA 上存在4个切割位点，Hind Ⅲ在质粒DNA 上存在3个切割位点，且两者的位点无重复，因此 Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切应该产生7个完整清晰的条带图谱，其中129bp 片段由于分子量太小，电泳中跑得太快，与拖尾的杂质部分有部分重叠，模糊或没切到无法辨认。

其中176bp 片段也由于分子量过小，电泳过程中跑太快而有点模糊。

499bp,436bp,370bp 三个片段，由于分子量较小且较相近，以致三个条带不够清晰。

2.2 分析根据限制性内切核酸酶特性可知，Pvu Ⅱ为第Ⅱ类酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA 的基础。

本实验中Pvu Ⅱ在质粒pUC19-P35S:ARF8上有4个识别位点，完全酶切可把质粒DNA 切割成4个分子量大小不同的片段，大小分别为2057bp,4500bp,4676bp,5981bp 。

Hind Ⅲ也属于第Ⅱ类酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA 的基础。

本实验中Hind Ⅲ在质粒pUC19-P35S:ARF8上有4个识别位点，完全酶切可把质粒DNA 切割成3个分子量大小不同的片段，大小分别为2236bp,5112bp,5611bp 。

Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ两种酶所识别质粒DNA 位点都不一致，因此两种酶对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切可产生7个大小不同片段，大小分别为：2366bp,2264bp,499bp,436bp,370bp,179bp ，129bp 。

但是，从图1电泳图谱可知，本次实验不成功，最下面出现一个较亮而大的团带，可能是质粒DNA 中含有杂质且分子量比DNA 小导致其在电泳条带图谱的尾部出现。

只可看出6个条带而非7个条带且不够清晰或酶切不完全，经讨论，出现此现象的原因可能有以下：1. 加样时，由于操作不佳，实验者把样品槽底部凝胶刺穿或损坏，影响了DNA 片段的移动。

2. 选择双酶切的两种酶的组合搭配得不好，Pvu Ⅱ和Hind Ⅲ识别的位点多数相近，以致双100bp2000bp 500bp 250bp 750bp 1000bp酶切得到的片段大小较接近且部分较小，电泳中分子量小的跑太快与尾部重叠，片段大小相近的电泳条带不够分离。

3.电泳时间过短，导致酶切的DNA片段跑得不够开。

4.制备反应混合液时没有加入BSA溶液，导致限制性内切核酸酶不稳定，酶活性下降或其酶切机理受到了破坏。

5.加入反应的酶的量过多，导致酶的活性受到了抑制，酶切不完全。

6.反应液混匀后，在室温条件下放置时间过长，影响了酶的活性。

另外，与其他同学和一班的电泳图谱比较，使用单酶切的电泳图谱条带要比双酶切的清晰完整，且选用EcoRⅠ进行单酶切得到的电泳图谱条带较多而清晰。

3.讨论本次实验采用PvuⅡ和HindⅢ对质粒pUC19-P35S:ARF8进行双酶切得到的DNA的电泳图谱不太好，我认为主要是酶的选择不太好，且应该选一种酶进行单酶切，得到的实验结果会更好。

其次，添加试剂的量要把握好，由于添加的试剂的量都是微量，稍微稍加或多加一点，都会对实验结果有较显著的影响。

除此之外，我们对加样操作不够熟练，还是容易出错，导致电泳结果不理想，所以加样时一定要特别地小心谨慎，使用的移液枪枪头要确保没被污染。

4.参考文献[1].陶志坚.限制性核酸内切酶相关知识总结.学知报.2011,01(8):1-3.[2].王智新，王昌留.限制性核酸内切酶及其显带研究进展.鲁东大学学报[J].2011，27( 2) : 154—157.[3].熊江霞,朱华庆,王雪等.限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析[J].安徽医科大学学报. 2003, 38 (2):147-148 .[4].宋平，李小迎，熊全沫.鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶切图谱的比较[J].水产学报.1994,18(3):221-230.[5].戴建华,殷文莉. 丰鲤及其双亲线粒体DNA限制性酶切图谱的研究[J]. 南京师大学报（自然科学版）, 2004, 27 (3)：332-336 .[6] 关海红,石连玉,刘明华等. 黑龙江野鲤线粒体DNA限制性内切酶酶切分析[J]. 水产学杂志, 2000, 13 (1)：256-260.[7].王荻,徐革锋,刘洋等. 两种双酶切组合在细鳞鱼AFLP体系中的比较分析[J]. 大连水产学院学报, 2009, 24 (5)：178-183.致谢在此论文完成之际，我要对论文完成过程中所有的人们表示衷心的感谢。