抗肿瘤抗生素力达霉素摘要：力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以通过发酵、生物合成以及化学合成获得。

力大霉素由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成，通过多种作用机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用。

目前，力达霉素已经进入Ⅱ期临床研究，本文介绍了力达霉素的发酵及生物、化学合成方法，抗肿瘤作用和分子作用机制方面的新进展。

关键词：力达霉素；发酵工艺抗肿瘤作用Abstract: Lidamycin, a member of the enediyne anticancer antibiotics family. Can be acquired by fermentation，biosynthesis，chemosynthesis. Lidamycin is composed of chromophore andapoprotein with noncovalent binding. It exerts potent antitumor activities on a variety of cancer in vitro and in vivo by different mechanisms. Lidamycin is currently evaluated in Phase II clinical trials. In this review we discussed recentprogresses in fermentation , biosynthesis , chemosynthesis ,molecular mechanisms and antitumor activities of lidamycin.Key words: Lidamycin; Fermentation process;Antitumor activity前言力达霉素(lidamycin, LDM)原名C1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离出的一株链霉菌Streptomyces globisporus c-1027产生的大分子肽类抗肿瘤抗生素，它是采用精原细胞法筛选得到的，其结构独特，由一个含110个氨基酸的酸性蛋白(MW10, 500)和一个含烯二炔结构的发色团(MW 843)通过非共价键结合而成(图1)，属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。

LDM在体外对多种肿瘤细胞具有强力的杀伤作用，在体内对小鼠移植肿瘤L1210、P388和S180等有明显的抑制作用，对移植于裸鼠的人体肿瘤也有抑制作用。

LDM分子可以进行拆分重建，发色团是LDM的活性部分，当发色团烯二炔芳构化后其活性丢失；蛋白对发色团起保护作用，游离发色团容易失活，重建LDM与天然LDM活性相同。

目前，LDM在国内已进入Ⅱ期临床研究，现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、抗肿瘤作用及其分子作用机制等方面的研究工作成果作一综述。

一、力达霉素的分子结构力达霉素为新型烯二炔类抗肿瘤抗生素,它由1个辅基蛋白和1个发色团成。

蛋白部分由110个氨基酸组成, 含有2个分子内二硫键, 计算相对分子质量为10500u,蛋白质部分没有抗肿瘤活性, 但对发色团有稳定和保护作用,并携带发色团到达肿瘤部位。

发色团在抗肿瘤活性中发挥主要作用,发色团由1个9元环1, 52二炔232烯核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶核糖和B2酪氨酸结合而成。

这些结构单元不但参与化合物分子的组成, 而且与化合物的生物活性密切相关。

借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确定各个结构单位的相对位置, 发现芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水口袋”处, 它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成静电和疏水作用。

二、力达霉素的发酵工艺材料和方法1 菌株力达霉素产生菌Streptomyces globisporus C-1027-20(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,入册编号CGMCC No.0704) 。

2 培养基斜面培养基(g ·100 mL -1) : 可溶性淀粉2.0,3KNO 0.1,32PO KH ·O H 20.05, 4MgSO ·O H 270.05 , 4FeSO 0.001 ,NaCl0.05 ,琼脂粉1.5,pH7.0。

种子及发酵培养基(g ·100 mL -1):淀粉1,葡萄糖0.5,血胨0.5,玉米粉1.5,玉米浆0.5, 4MgSO ·O H 270.02,KI 0.06, 3CaO 0.4 ,豆油0.3,pH7.0 。

3 培养条件用冷干管中保存的菌种在斜面培养基上传代培养,28℃培养7～10d ,传2～3代,备用。

一级种子用500mL 三角瓶内装100mL 培养液,从斜面挖块接种,在转速为190r ·min -1的旋转摇床上28℃培养48 h 。

二级种子用5000mL 三角瓶,内装1000mL 培养液,接种量为10% ,在振荡速率为90r ·min -1的来回摇床上28℃培养24h 。

发酵培养用200L 发酵罐,内装培养液100L ,接种量为2% ,搅拌速度200r ·min -1,28℃培养约96h 放罐。

4 检测方法微生物测定法检测发酵液中力达霉素的含量:取发酵液适当稀释,检定菌为枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501 ] ,标准品的浓度为5μg ·mL -1 ,用一剂量法测定力达霉素发酵液的抗菌活性。

用二剂量法测定力达霉素发酵提取物的抗菌活性,剂量为12μg mL -1·与3μg ·mL -1。

HPLC 法测定力达霉素发酵提取物的含量:精密称取待测样品和标准品510mg ,用蒸馏水溶解于5mL 容量瓶中,用于HPLC 测定。

色谱条件:Waters 高效液相色谱仪( 600 泵, 2487 紫外检测器,Millennium32色谱工作站) ; 色谱柱:Waters Delts PakC4 柱( 319 mm ×150 mm , 5μm , 30 nm) ; 流动相:01025 %三氟乙酸2乙腈(23∶77) ;检测波长:350 nm 。

液相色谱图见图2。

分别测定力达霉素样品及标准品发色团的峰面积,按照外标法计算样品的效价。

图2力达霉素典型液相色谱图精原细胞法测定力达霉素抗肿瘤活性:使用体重22～28g的雄性小鼠,分别于2侧睾丸内注射被试样品的溶液。

每一种样品的每一浓度用2～3只动物。

注射后2～4d(一般为3d)处死动物,取睾丸固定于Bouin氏液,石蜡包埋切片,切片厚度为5μm ,苏木精2伊红染色,显微镜下观察结果。

药物引起的精原细胞的特异性消失作为阳性。

结果表1为5批中试发酵液的测定结果,表2为5批中试发酵提取物的测定结果。

结果显示:5批发酵液微生物效价平均为450μg·mL-1 ;5批100 L发酵罐平均每罐产合格的力达霉素精品517g。

经过多批中试,摸索出了上罐条件,为力达霉素生产的下游提取提供了充足的发酵液,经过分离纯化,积累了足够的临床试验用药。

讨论此生产菌种较稳定,发酵培养基较廉价,发酵工艺过程也很好控制。

发酵液放罐后,由于力达霉素在常温下不稳定,故发酵液提取须在低温(10℃以下)避光条件下迅速提取,以避免活性成分的丢失。

力达霉素3种检测方法中,HPLC法最准确,但不能直接测定发酵液效价;微生物检定法易操作,经济实用,但不如HPLC法精确;精原细胞法可以测定样品是否具有抗肿瘤活性,但不易操作。

故在发酵液生产阶段用微生物法测定含量,原料药用HPLC法和微生物法测定含量。

从表2结果可以看出,微生物法及HPLC法测定得出的结果是平行一致的。

三、力达霉素化学合成的研在力达霉素的化学结构得到解析后, 很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作, 希望通过化学手段可以合成出活性相当乃至更强的化合物。

根据逆合成分析,朱锦桃等合成了烯二炔发色团中五元环状中间体, 并在此基础上合成了发色团中烯二炔单元的开链衍生物, 但并未得到闭环的烯二炔结构。

Inoue 等在对发色团的结构进行了充分研究之后对发色团的骨架结构和烯二炔的双环结构进行了合成。

由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解, 该实验室还利用同位素氘(D)取代辅基蛋白Gly96的H原子, 改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团结构降解的速率, 增加其稳定性。

Semmelhack 等报道了由甘露糖出发经12步反应合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的路线, 认为合成反应的关键步骤在于C24位的内部N取代从而引顺式氨基以及C25位上烯醇化物的甲基化。

四、力达霉素的生物合成力达霉素的发色团核心的烯二炔结构的生物合成途径一直是人们关注的焦点。

烯二炔结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径, 由烯二炔聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS) 催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成，接着采用一种新颖的环化机制而形成烯二炔核心结构。

刘文等运用PCR方法成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dNTP2葡萄糖24, 62脱水酶基因(sgcA ) ,并以此为探针,通过基因文库筛选和染色体步移克隆了完整的生物合成基因簇,发现力达素的生物合成起源于聚酮代谢途径, 并确定了基因簇编码1个烯二炔聚酮合成SgcE,排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。

除了聚酮合成酶SgcE, 刘文等还提出了一系列途径特异的结构基因分别控制各个结构单元的合成。

sgcE2-sgcE11、sg cI、sgcJ 、sgcL 和sgcF 等16 个基因负责烯二炔核心的合成; sgcA-sgcA6 等7个基因sgcA1-sgcA6参与脱氧氨基糖的合成; sgcC-sgcC5 6等基因参与β-氨基酸的合成sgcD-sgcD6等7个基因负责杂萘苯环的合成。

通过各自途径生物合成的这三个结构单元分别在糖基转移酶(SgcA6)、缩合酶(SgcC5) 和酰基转移酶(SgcD6)的催化作用下, 与烯二炔核心结合, 构成完整的力达霉素发色团分子。

对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中, 通过生物信息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验以及利用基因工程手段将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析可以确定这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能, 并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反应步骤的信息。

目前已陆续报道了sgcD、sgcA 1、sgcC1 等结构基因的研究分析结果。

五、力达霉素的抗肿瘤作用1 体外抗肿瘤作用LDM是经过精原细胞法筛选得到的，在体外具有极强的杀伤肿瘤细胞的作用。