分子克隆基本操作
一、PCR（聚合酶链反应）扩增体系
实验成分加入量（ul）终体积
模板DNA 0.1
dNTP 0.4
上游引物（P1）0.5
下游引物（P2）0.5 20 ul
10×Taq Buffer 2.0
TaqDNA聚合酶0.1
ddH2O 16.4
PCR全过程是由变性、模板与引物结合（复性）及引物延伸3个步骤组成的不断重复过程：
反应条件
PCR反应变性退火延伸循环周期１940C预变性5min 1
２940C 1 min 50~570C1 min 720C 1 min 25~35 ３720C 5min
(反应结束后，样品可与40C暂存)
二、PCR产物的凝胶电泳检测
1.1%琼脂糖凝胶配制：
配胶：将卡子放于制胶器孔中；
称取0.3g琼脂糖溶于30ml 1×TAE之中置于微波炉中煮沸三次；
倒胶：待温度降低600C左右时（手感容器能耐受），在凝胶中加入EB 至终浓度0.5ug/ml（30ml凝胶1.5ulEB）,摇匀后缓慢倒入制胶器中。

避免产
生气泡，尤其注意梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管吸去。

凝胶条件：在室温中放置30~45min.。

拔梳子：小心垂直拔出梳子，保持点样孔完整。

2.加样：
凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm。

将PCR产物与6×加样缓冲液，混合均匀加至加样孔中。

同时，根据待分离片段的大小选择不同的DNA分子量标准作对照。

加样孔处于电泳槽的阴极端。

（加样是勿碰坏凝胶孔壁，否则DNA带型不整齐。

）
3.电泳：
接通电源，开启电源开关，观察正负两极是否有气泡出现，且负极比正极气泡多，设置电泳电压及电泳时间（电泳时间视具体样品而定，一般15~30min）。

4. 拍照：
胶置于凝胶成像分析仪中，根据图片用途调整焦距及灯光。

三、DNA切胶回收
1.切胶: 于紫外灯下确定欲回收的DNA片段，取干净EP管称重m1标记，用
手术刀切下含有目的DNA片段的凝胶块，置于EP管中。

（观察和切胶含目的DNA片段的凝胶时，紫外灯照射时间不宜过长，以减少紫外线对DNA的损伤、剪切或引起基因的突变。

）
2.称总重m2，则胶重为m2-m1, 按胶重量加入Binding Buffer。

3. 将EP管置于55-65℃水中融化7min, ,每2-3min震荡一次。

4. 将混合液体加入HiBind管柱中室温离心10000*g 1min 弃取收集液。

5. 加入300ulBinding Buffer洗柱离心10000*g 1min。

6. 加入700ulSPW Wash Buffer, 室温放置2-3min, 离心10000*g 1min 弃取收集液。

7. 重复⑥
8. 空柱离心10000*g 1min,充分干燥柱上的DNA,弃取收集液。

9. 将柱子移入空1.5mlEP管中,加入20ulDNA Elution Buffer, 离心10000*g 1min。

四、建立酶切体系
目的片段酶切体系
实验成分加入量（ul）
胶回收产物 5.0
酶切酶1 0.5
酶切酶2 0.5
Buffer 2.0
ddH2O 2.0
克隆性基因载体的酶切体系
实验成分加入量（ul）
克隆性基因载体（质粒） 2.0
酶切酶1 0.4
酶切酶2 0.4
Buffer 2.0
ddH2O 5.2
五、凝胶电泳检测及胶回收
同二、三两步
六、目的基因与克隆载体的体外重组（连接）
实验成分加入量（ul）
目的基因胶回收产物5~7
克隆性基因载体胶回收产物 1
水浴450C 5min 冰水浴00C 3min(静置)
T4 Ligase 1
10* T4 Ligase Buffer 1
160C过夜
七、重组克隆基因引入受体细胞（转化）
⑪、-70℃取出TOP10 50uL（置1.5ml EP管中），立即冰水浴10min。

⑫、加入5uL上述连接产物，轻轻混匀（在超净台中完成）。

⑬、放入0℃冰水浴30min（放于4℃冰箱）。

⑭、而后放入水浴锅中42℃热休克90秒（严格控制时间）,转入0℃冰水浴3min。

⑮、加入800ul LB培养液，置摇床37℃孵育45min-1h。

⑯、将其取出，5000rpm离心5min，弃上清留约100uL残液均匀涂于LB平板上(LB平板预先烘干)置37℃培养箱中培养12-16h.
八、含目的基因重组体的筛选（挑单克隆菌落）
取出上述LB平板置于超净台中，并同时取试管架,EP管架各一只、LB培养液一瓶（个人专用）、氨苄青霉素（AM P﹢）。

⑪、点燃酒精灯，取干净试管（数目依据欲挑菌数）。

⑫、每管加入5mL LB培养液（无菌操作）。

⑬、分别加入5uL氨苄青霉素（AM P﹢）。

⑭、挑单个菌体，用移液器枪头（或接种棒）轻挑放入试管中（试管要倾斜，切勿将移液器放入试管中）塞上试管塞，之后平板放置4℃冰箱保存。

⑮、置于37℃摇床，摇菌12-16h。

⑯、摇菌5h后可以进行菌液PCR鉴定
九、重组质粒的制备（小提质粒）
重组质粒的少量制备按OMEGA bio-tek公司的质粒少量快速提取试剂盒操作.
①取一个新的 HiBind DNA结合柱装在收集管中，吸取200uL Buffer GPS平衡缓冲液至柱子中，室温放置3-5min，室温下，12000*g离心2min。

②取1ml菌液装于EP管中10000*g,离心10min,弃上清.
③加入250ul Solution I,重悬菌落,混合均匀. 加入250ul Solution II,轻轻地上下颠倒数次,而后静置2min. 加入250ul Solution III, 轻轻地上下颠倒直至白色絮状物形成为止.10000*g,离心10min.
④将③离心管中的清晰液体吸至HiBind柱中（切勿将白色絮状物吸入）, 10000*g,离心1min.
⑤弃去收集液,向HiBind柱中加入500ulBuffer HB, 10000*g,离心1min.（重复一次）
⑥弃去收集液, 加700ul DNA Wash Buffer, 10000*g,离心1min.
⑦重复⑥步
⑧空柱13000*g,离心2min,充分干燥柱子.
⑨.把柱子移置洁净的1.5EP管中,加入15-30ul Elution Buffer，室温静置两分钟,12000*g 离心2min.（将收集液从新吸入柱子，12000*g离心2min）。

⑩4℃暂存，-20℃长期保存.
十、双酶切鉴定
建立酶切体系:
成分用量
质粒 2.0ul
酶 1 0.5ul
酶 2 0.5ul
Buffer 1.0ul
ddH2O 6.0ul
总计 10ul体系
酶切条件:37℃水浴4h取全量酶切产物以2000DL为Marker,1%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

十一、测序。