O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
梭 菌 蛋 白 酶
• 梭状芽孢杆菌中分离，专一性强 • R1=Arg 。
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰水解法：它能选择性地切割由甲 硫氨酸的羧基所形成的肽键。 羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。
4 、鉴定多肽链 N －末端、 C －末端氨基酸残 基
多肽链的另一部分样品进行末端残基的确定，以 便建立两个重要的氨基酸序列参考点，方法比较多。
5、裂解多肽链成较小的片段
酶解法，化学法。
采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套 或多套肽段，并将其分离。
6、测定各肽段的氨基酸序列
7、片段重叠法重建完整多肽链一级结构
质谱法(Mass Spectrometry, MS)，即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、 分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量， 就可以确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两 个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。
一级结构的化学键？
2.一级结构的意义
测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义：
• 测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生 物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给 出更多的信息。 • 为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的 限制，顺序测定是必须的。 • AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病， 所以顺序测定是分子病理学的一个重要部 分。 • 蛋白质中的AA顺序很能指明它的进化史。
二硫键位置的确定
+
第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51氨基酸组成。含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼
凑出整条多肽链的AA顺序。
8、确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的 位置 不包括辅基成分分析
（二）鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸 残基
Sanger法（二硝基氟苯反应）
N端
DNS法（丹磺酰氯反应）
Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
氨肽酶法
肼解法
C端
羧肽酶法 LiBH4还原法
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
3.LiBH4还原法
多肽+ LiBH4
水解
α-氨基醇+ n氨基酸
含C—端氨基酸,用层析法鉴定
（三）二硫桥的断裂
几条多肽链通过 二硫键交联在一起。 可在8mol/L尿素或 6mol/L盐酸胍存在 下，用过量的巯基乙醇(还原法) 处理，使二硫键还 原为巯基，然后用 烷基化试剂碘乙酸 （ICH2COOH）保护 生成的巯基，以防 止它重新被氧化。
4.根据核苷酸序列的推定法
蛋白质链 核糖体
（七）肽段在多肽链中次序的决定
重叠肽（overlaping peptide）—— 片段重叠法重建完整多肽链一级结构
片段重叠法重建完整多肽链一级结构 所得资料：
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
OUS PS
第二套肽段
SEO WTOU
EOVE
RLA
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
嗜 热 菌 蛋 白 酶
• R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met 以及其它疏水性强的氨基酸水解速 度较快。 • R2=Pro或Gly 水解受抑。 • R1或R3=Pro 水解受抑。
H2N CH C N- 端 氨 基 酸
+
HN CH C HN CH C OH C -端 氨 基 酸 O Rn O
H H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH NH2NH2 C -端 氨 基 酸 氨基酸酰肼
R
2. 羧肽酶的方法
是目前最有效也是最常用的方法。 羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链的C －端依次切下一个氨基酸残基，释放出游离的氨 基酸。据一定时间内切下的数量来测氨基酸的数 量。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B 来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。
• 或胰凝乳蛋白酶： 糜 • R =Phe,Trp,Tyr时 1 蛋 水解快; 白 酶 • R1=Leu，Met和His 水解稍慢。 • R2=Pro 水解受抑。
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
胃 蛋 白 酶
• R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它 疏水性氨基酸水解 速度较快。 • R1=Pro 水解受抑
多肽 多肽
DNS-氨基酸
具有荧光，检测灵敏度高
(3)Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
PITC
无N-端氨基的剩余部分
用层析法分离
(4) 氨肽酶法
从多肽链的N未端依次向内切
NH2 ---aa---aa---aa---aa……. 据一定时间内释放出的AA的数量和种 类来推测.

常用的是亮氨酸氨肽酶（LAP）：当N端 第二个氨基酸是脯氨酸时，LAP不能将N 端氨基酸水解下来
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
胰 蛋 白 酶
• R1=Lys和Arg 侧链（专一 性较强，水 解速度快）。 • R2=Pro 水解 受抑。
O NH CH C R1 R2
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
N-未端的测定方法
(1) Sanger法 DNFB （二硝基氟苯）反应
H O2N O2N DNFB F H O2N O2N N H C R1 C O H N O C N H H C
O
H C O N
H C R2
O C N H
H C R3 C
O
H N
H C R4
O C N H
H C R5 C
O
F
+
N H2
C-未端的测定方法
1.肼解法
是目前最好的方法 用色谱法鉴定 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸 即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成 肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于 水的物质而与C-端氨基酸分离。 注:末端若为半胱氨酸或胱氨酸就不能用此 法，必须烷基化后再肼解。
R
O
R n-1O
Rn O
确定原多肽链中二硫键的位置。
二 硫 键 位 置 的 确 定
1、采用胃蛋白酶水解：切点多，生成的
肽段包括含二硫键的肽段都比较小；酸性环 境下防止二硫键发生交换，二硫键稳定。
2、将所得的肽段利用对角线电泳技术 进行分离。 3、然后同其它方法分析的肽段进行比 较，确定二硫键的位置。
对角线电泳： 把水解的混合肽段点到滤纸中央，在 pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将 按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤 纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时 每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨 磺酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全 相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大 多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一 条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来 含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都 偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。
VERL
APS
HOWT
HO
借助重叠法确定肽段次序：
末端残基 H
末端肽段 HOWT
S
APS
第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS
第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS
（八）确定半胱氨酸残基间形成二硫键 交联桥的位置 蛋白质一级结构的顺序测定完成后， 将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次 进行专一性的酶解，将含二硫键的肽段 进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该 肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成 二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链 氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键 位置。
（六）肽段氨基酸序列的测定
1、 Edman法（苯异硫氰酸酯法） Edman于1950年首先提出。
顺序分析的 N-端分析法 最主要的方法 特点：能够不断重复循环，将肽链N-端 氨基酸残基逐一进行标记和解离。
PITC
PTC-肽
2、氨肽酶法或羧肽酶法 3、质谱法（MS）
灵敏度高、所需样品少、测定速度快
1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。