1.蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。

1.蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象（高级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)1.一级结构的要点．1.蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。

（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。

（3）测定多肽链的氨基酸组成。

（4）断裂链内二硫键。

（5）分析多肽链的N末端和C末端。

（6）多肽链部分裂解成肽段。

（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。

（9）确定多肽链中二硫键的位置。

1.蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。

1.直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4B 法裂解 B1 B2 B3 B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。

1. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测600-800bp1. 测序前的准备工作1. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。

（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS —cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸1. 测定分子量用于估算氨基酸残基n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法1. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：⑴非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3Hβ巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 (α2β2)（注意，人的血红蛋白α和β的N 端相同。

）分子量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆二硫键： M 1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M 1 + 2M 21. 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。

氨基酸分析仪自动进行。

确定肽链中各种a.a 出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。

①Trp 测定对二甲基氨基苯甲醛 590nm 。

②Cys 测定5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB ，412nm1. 端基分析①N 端分析DNS-cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。

DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等PITC 法：Edman 法，逐步切下。

无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。

②C 端分析110mwA．肼解法H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。

A-NHNH2、 B-NHNH2、 C-NHNH2、 D-COOH氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。

B．羧肽酶法（Pro不能测）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a羧肽酶B：只水解Arg、LysN H2N……………Val—Ser—Gly C图 P118 羧肽酶法测C末端1.肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1.化学裂解法①溴化氰—Met—X—产率85%②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—④羟胺NH2OH —Asn—Gly—约150个氨基酸出现一次1.酶法裂解①胰蛋白酶(X ≠Arg—— X②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X(X ≠ Pro)Trp——XPhe——X胃蛋白酶Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)③Glu蛋白酶 Glu——X（V8蛋白酶）④Arg蛋白酶 Arg——X⑤Lys蛋白酶 X——Lys⑥Pro蛋白酶 Pro——X1.肽段的分离纯化①电泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离③反相ＨＰＬＣ法根据肽段的极性分离④凝胶过滤1.肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。

1.肽段的序列测定及肽链的拼接2.Edman法一次水解一个Ｎ端a.a（1）耦联PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9 ，40℃ PTC——A-B-C-D……（2）裂解PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D （3）转化ATZ—A PTH—A用GC或HPLC测定PTH-APTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）耦联：得PTC肽一次循环裂解：ATZ- a.a转化：PTH-a.a反应产率 99％循环次数 120(偶联、降 98% 60解两步） 90% 403.DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。

Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽图4.有色Edman法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。

5.用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法，可测60肽。

1967液相测序仪自旋反应器，适于大肽段。

1971固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。

1981气相测序仪用Polybrene反应器。

（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol 20-40肽 97%气相：5pmol 60 肽 98%6.肽段拼接成肽链16肽，Ｎ端H Ｃ端ＳＡ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWTＢ法裂解：SEO WTON VERL APS HO重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS7.二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定8.二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。

9.酰胺的确定Asp –Asn、Glu-Gln酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。

10.糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷脂类：Ser、 Thr、Cys磷酸：Ser、 Thr、His经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)11.蛋白质的一级结构与生物功能12.蛋白质的一级结构决定高级结构和功能蛋白质一级结构举例：（1）牛胰岛素Sanger于1953年首次完成测序工作。

P128 图3-38分子量：5700 dalton51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11A.B链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7A.Cys 20—B Cys 19（2）核糖核酸酶（RNase）P128 图3-39分子量：12600124个a.a残基4个链内二硫键。

牛胰RNase变性一复性实验：P164 图3-69。

(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。

（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构P129 图3-4013.同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。

如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。

同源蛋白质的特点：①多肽链长度相同或相近②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。

③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。

通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。

14.细胞色素C存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。

P130，图3-41分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。

25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。

60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。

亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。

亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。

人与黑猩猩 0人与猴 1人与狗 10人与酵母 4415.胰岛素祥见 P175 胰岛素的结构与功能不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。

其它氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。

16.蛋白质一级结构的个体差异—分子病分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。

Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的α链和两条相同的β链组成α2β2，镰刀形红细胞中，血红蛋白β链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。

因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。

以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白正常人血红蛋白，β.N......Glu 6镰刀型贫血β.N......Val 6生理条件下电荷：Va10 Glu-疏水亲水人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。

17.一级结构的部分切除与蛋白质的激活一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。

18.血液凝固的机理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原凝血酶纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶（1）、凝血酶原P133 图3-43 凝血酶原的结构糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。