天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2007,19:2162220文章编号:100126880(2007)022******* 收稿日期:2006206219 接受日期:20062082283通讯作者Tel:86221262232019;E 2mail:wiqn@bi o .ecnu .edu .cn药用真菌金耳的r DNA I TS 序列分析与鉴别刘春卉,瞿伟菁3,张 雯,焦 磊华东师范大学生命科学学院,上海200062摘 要:研究了两个居群的金耳Tre m ella aurantialba 以及近似品的r DNA I TS 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的I TS 和5.8Sr DNA 完整序列,序列总长度为467～468,长度变异较少。
聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支。
I TS 序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。
关键词:金耳;核糖体DNA;I TS 序列;居群;近似品;DNA 分子鉴别中图分类号:R28415文献标识码:AD NA M olecul ar I den ti f i ca ti on of M ed i c i n a l M ushroo mTrem ella au ran tia lba Ba sed on I TS SequencesL I U Chun 2hui,QU W ei 2jing 3,Z HANG W en,J I A O LeiSchool of L ife Science,East China N or m al U niversity,Shanghai 200062,ChinaAbstract:The r DNA I TS sequences fr om t w o populati ons in China were studied and three anal og s pecies were discussed t ogether .The whole sequences of r DNA I TS regi ons (including I TS 21,5.8S and I TS 22)of T re m ella aurantialba were re 2ported first ti m e .The results showed that little difference in length bet w een the sequences was f ound and the length was 467bp and 468bp,res pectively .T re m ella aurantialba and T re m ella aurantia f or med a separate stable branch in the t opol 2ogy trees,while T re m ella m esenterica clustered on another clade .The relati onshi p bet w een t w o populati ons of Tre m ella aurantialba in Yunnan and Shanxi p r ovinces and Tre m ella aurantia is cl osely related,and they can rep lace each other asthe sa me medicine according t o the r DNA I TS .The character of I TS sequences can be used f or p r oviding the molecular markers f or identifying Tre m ella aurantialba and exp l oring its genetic basis of fungal s ources .Key words:Tre m ella aurantialba ;r DNA;I TS sequence;populati on;anal og s pecies;DNA molecular identificati on 金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳(Tre m ella aurantia lba )的金黄色脑状子实体,为珍稀濒危真菌,民间对其药用历史悠久,《本草纲目》和陶弘景《名医别录》有记载,《中国药用真菌》述其主治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症[124]。
同属还有近似种金黄银耳T re m ella aurantia Sch w:Fr 、脑状银耳Tre m ella encephala Pers .、黄金银耳(与橙黄银耳同物异名)Tre m ella m esenterica Retz .:Fr .。
现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖,连续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[5],金黄银耳子实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平[6,7],黄金银耳子实体有较强的平喘作用[8],其多糖也有降低大鼠高血糖作用的报道[9]。
由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且易混淆,金耳种名一直被误定为Tre m ella m esenterica [10,11],原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪九十年代才得以确认并正式定名T re m ella aurantial 2ba Bandoni et Zang [12,13]。
鉴于同属的近似品种较多,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别,同时近似种已有相似药理作用的报道,为防止品种源头混乱,保护种质资源,解析其它近似种的种质差异及可替代性,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行准确界定,不仅有助于规范资源的生产和保存,也可丰富生药资源库和数据库的基础信息。
通过检索Gen Bank 和E MBL 数据库,发现近似种金黄银耳Tre m ella aurantia 、脑状银耳Tre m ella encephala 、黄金银耳Tre m ella m esen terica 的r DNA I TS (核糖体内转录间隔区)序列均已注册,而金耳Tre m ella aurantial 2ba的I TS序列尚无录载。
真菌核糖体中的内转录间隔区序列的进化速率较快,可以提供较丰富的变异位点和信息位点,不仅广泛用于近缘属间、属内种间的分子系统学及鉴别,而且也被用于种内居群间的差异性研究,为此研究选择国内两个地域较远的金耳品种的r DNA I TS区碱基全序列作为分子标记进行测定,并结合Gen Bank收载的近似品的I TS序列进行分析,试图为金耳药材的种质鉴定提供分子依据。
1 材料和方法1.1 材料金耳Tre m ella au rantialba子实体分别为9901产地为云南丽江(简称A13),9102产地为山西(简称A23,以下括号内均为简称),由瞿伟菁教授鉴定。
GenBank收载本研究引用的其它银耳属真菌及其GenBank登录号如下:金黄银耳Tre m ella aurantia AF444315(Ta)、脑状银耳Tre m ella encephala AF410474(Te1),AF042404(Te2),AF042402(Te3)、黄金银耳Tre m ella m esenterica AF042448(T m1), AF042443(T m2)、银耳(白木耳)Tre m ella fucifor m is AF444316(Tf)。
1.2 总DNA提取总DNA提取基本依照氯化苄法[14]略加改进,步骤如下:收集消毒供试子实体各0.1g,加0.5mL 提取液(0.1mol/L Tris HCl,pH9.0和0.04mol/L EDT A,pH8.0)研磨混匀,加0.1mL10%S DS和013mL氯化苄充分混匀,50℃保温1h,加0.3mL3 mol/L Na OAc(pH5.2)混匀,冰水浴15m in,6000 r pm室温离心15m in,取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20m in,去上清,10000r pm室温离心15m in,沉淀用70%乙醇洗一次,风干后水溶,4℃保存, 1.5%Agr ose琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30m in)检测纯度和分子量范围。
1.3 r DNA I TS区的扩增、纯化和测序采用双向PCR反应扩增I TS125.8S r DNA2I TS2整个片段,用18S r DNA3′端引物作上游引物I TS1: 5′2CGT AACAAGGTTT CCGT AGG23′,用28S r DNA5′端引物作下游引物I TS4:5′2TCCTCCGCTT ATT2 G AT ATGC23′。
反应体系(50μL)含:模板:5×1029 g,引物I TS1和I TS4(2×1025mol/L)各1μL,10×PCR缓冲液(pH8.3)5μL,dNTP(0.01mol/L)4μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL(引物和Marker购自上海生工,Taq酶和dNTP购自大连宝生物公司),灭菌双蒸水定容至50μL,加好后上盖石蜡油25μL。
扩增条件:94℃预变性5m in,94℃1m in,55℃45s,72℃1m in,循环30次,72℃延伸5m in,产物于4℃保存。
Agr ose琼脂糖凝胶电泳检查产物(Marker分子量范围100～1200bp),产物纯化回收(北京鼎国公司PCR产物试剂盒),每样平行重复5次,纯化后的产物以与PCR相同的引物双向直接测序(华大基因上海鼎安公司完成)。
1.4 序列分析用DNAStar(DNAStar,I nc.1996)软件包编辑, ClustalW对位排序,在线BLAST检索,从Genbank 中提取其它相关真菌的I TS序列,用Mega2.0分子进化遗传分析软件,选择药性较近的药用菌木耳A uricularia auricular AF291268(Aa)作为外类群[1,15],统计和分析序列的变异情况,采用系统学分析软件P AUP4.0中的邻接法(neighbor2j oining method,NJ),最大简约法(maxi m um parsi m ony meth2 od,MP)和最大似然法(maxi m um likelihood method, ML)推测系统关系。