全日制专业学位硕士研究生课程考试试卷（课程名称：植物生物技术概论）学位课 选修课□研究生年级：2013级姓名、学号：侯夏乐 2013050125学院（系、部）：农学院专业学科：作物学任课教师：韩德俊考试日期：2013年 12 月考试成绩：教师签字：白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的提取纯化研究计划研究背景α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor，简称a-AI)是一种天然生物活性物质，属于糖苷水解酶的一种，国外称之为“starchblocker”。
a-AI能抑制肠胃道内唾液、胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到降低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高，从而有利于糖尿病患者的饮食治疗。
对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体重。
因此，可以用a-AI来防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。
天然存在的a-AI主要有3种类型，分别为[1](1)微生物产带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物；(2)微生物产多肽，如paim(来自微生物的猪胰a-AI淀粉酶抑制剂)和Haim(微生物起源人a-淀粉酶抑制剂)；(3)在豆类、谷类及其他较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。
Bowman(1945年)首次报道从芸豆中获得a-A1[2]。
白芸豆中提取的a，AI是一种具有N端糖基化的糖蛋白[2]。
作为一种热稳定的糖蛋白，a-AI 是在内质网上合成，储存在液泡内，要经过蛋白水解酶水解去抑制作用才能成为有活性的a-AI。
芸豆中发现的a-A1[3]已有3种，分别是aAI-1、aAI-2和aAI-3。
其中从芸豆中分离纠的aAI-1，是由两个糖肽亚基α(7．8 kD)和β(14 kD)组成。
它能抑制猪胰腺淀粉酶(PPA)、人胰腺淀粉酶、人唾液腺淀粉酶和一些鞘翅昆虫四纹豆象、绿移象、粉虫的α-淀粉酶。
张琪等的实验研究表明[4]a-AI能降低小肠各部分尤其是小肠前端的二糖酶活性。
由此可推测a-AI抑制了与淀粉吸收相关的胃肠道内多种淀粉酶的活性，使食物中大虽的糖类主要在小肠的末端才被吸收，从而延长了食物在肠道中的消化时间，导致机体吸收葡萄糖的速率下降，因而可有效改善小鼠进食后血糖波动情况，使葡萄糖耐量曲线变得平缓，保持血糖餐后稳定在正常水平或接近正常水平范围内，因此起到降低血糖及治疗糖尿病的作用。
通过建立大鼠食饵性高脂血症模型，发现[5]a-AI调节血脂的机制可能与其抑制淀粉酶活性有关。
淀粉糖类物质的摄取减少，可使脂类在体内的合成减少，并使一部分脂类转化成糖以供机体生理的需要，从而起到降低血脂的作用。
a-AI可降低血清及肝脏MDA含量，升高SOD活性，表明其可通过抑制脂质过氧化物的产生及提高自身抗氧化酶活性，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。
Leonardo Celleno等的实验研究显示[6]，作为实验对象的肥胖者(男性和女性)给予每天富含碳水化合物(2000～2200卡路里)的食物，同时食用含白芸豆提取物的药物，其作为一种主要的影响因素，能显著减少体内的脂肪近而减轻体重。
这种白芸豆提取物在减轻和维持正常体重方面体现出其安全性和高效性。
研究目的和意义随着社会生活水平和经济收入的提高，人们对食品安全和自身健康有了更高层次的要求。
从天然食品中寻找具有生物活性的功能因子，因为具有更高的安全性和功效性，成为保健食品研究开发中最活跃的前沿领域。
特别是在现代营养学和现代生命科学研究的基础上，开展对天然产物活性成份的分离、纯化、结构测定及功效关系的研究更是促进人类健康的一项极为重要的研究课题。
a-AI是一种新型糖尿病治疗药物，它以人体糖代谢的关键酶甜淀粉酶为作用靶点，通过抑制其生物活性，减少食物中碳水化合物的消化吸收，减少脂肪生成，从而起到降糖、降脂和减轻体重的作用。
与其他降糖减肥产品相比，具有安全无毒、耐受性好的特点，尤其适合长期使用以达到预防和治疗的作用。
亚洲人的饮食结构以淀粉为主，因此从控制机体糖代谢中的关键酶的活性入手，开发a-淀粉酶抑制剂对特定人群的降糖、降脂及减肥具有极大的应用前景。
芸豆是我国主要的食用豆类，在我国已有500年的种植历史，其不仅营养丰富，而且具有药用价值，是我国传统的药食同源食品。
白芸豆中含有较高活性的a-淀粉酶抑制剂，其化学成分为一种复合糖蛋白，结合糖蛋白的分离和结构研究方法，对白芸豆中a-AI的提取、纯化、组成结构、理化性质、生物活性、构效和量效关系进行全面系统的研究，既可为白芸豆a-淀粉酶抑制剂的保健产品开发提供理论基础和应用依据，也可为其它功能性糖蛋白的研究和开发提供方法借鉴。
本研究在现有研究的基础上，参考现有文献资料和糖蛋白分离纯化的方法，确定最佳的a-淀粉酶抑制剂提纯工艺，并对白芸豆中的a-淀粉酶抑制剂糖蛋白的超滤提取工艺进行研究，为将从白芸豆中提取、分离纯化的a-淀粉酶抑制剂作为减肥和治疗糖尿病的有效药物、保健品进行开发利用而提供有效的实验基础和应用依据，也为其规模化工业生产提供了技术参数。
研究设想1、白芸豆中a-淀粉酶抑制剂的提取方法研究，确定最佳提取工艺并进行分离纯化（1）、用DNS比色法测定a-淀粉酶抑制剂的活性，在不同的吸收波长，不同的DNS试剂用量，不同的显色反应时间来确定对白芸豆中分离纯化的a-淀粉酶抑制剂的DNS比色法最佳条件。
（2）、选择白芸豆籽粒粉碎粒度、料液比、NaCl溶液浓度以及乙醇浓这几个因素来考量其对所提取a-淀粉酶抑制剂含量的影响，为进一步的正交试验设计和最佳浸提工艺的确定提供参考。
（3）、进行正交试验确定最佳工艺条件，并进行验证。
（4）、对浸提工艺获得的白芸豆a-淀粉酶抑制剂粗品进行DEAE-Cellulose 离子交换树脂柱层析洗脱，获得白芸豆a-淀粉酶抑制剂样品，并测定抑制活性。
（5）、通过Sephadex G-75凝胶柱层析对所提取的白芸豆a-淀粉酶抑制剂样品进行了进一步的分离纯化，获得了白芸豆a-淀粉酶抑制剂产品，并测定抑制活性。
2、白芸豆中a-淀粉酶抑制剂糖蛋白超滤提取工艺研究（1）、采用有机超滤膜对白芸豆提取液中的a-淀粉酶抑制剂糖蛋白进行超滤浓缩，选用不同的节流分子量，操作压力，温度，物料质量分数，操作时间以确定最佳的提取条件,并测定活性提取率。
（2）、采用膜孔径为50nm的无机陶瓷膜对白芸豆提取液中的a-淀粉酶抑制剂糖蛋白进行超滤浓缩，选用不同的节流分子量，操作压力，温度，物料质量分数，操作时间以确定最佳的提取条件,并测定活性提取率。
（2）、对比以上两种方式，确定那种膜更适合于白芸豆中a-淀粉酶抑制剂糖蛋白的分离浓缩。
研究所需的方法1、提取及分离纯化工艺路线研究工艺路线[7]：白芸豆→粉碎(过60目筛) →NaCl溶液浸提过夜→离心(10 000rpm，4℃) →上清70℃水浴→离心→乙醇醇沉→白芸豆a-AI粗品→DEAE离子交换柱层析→Sephadex G75凝胶柱层析→收集蛋白峰→白芸豆a-淀粉酶抑制剂产品。
实验操作：白芸豆籽实粉碎之后过60目筛网，此原料1009按照料液比(W白芸豆／V Nacl ) l：6加入1．5％NaCl溶液浸提过夜，离心(10 000rpm，4℃)后取上清704℃水浴15min，然后离心获得上清液，经70％乙醇醇沉(4℃)，即获得白芸豆a-淀粉酶抑制剂粗品。
然后经DEAE离子交换柱层析，0．02mol／LpH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-0．3mol／LNaCl)梯度洗脱，收集活性蛋白峰。
进行Sephadex G75凝胶柱层析，0．02mol／LpH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液梯度洗脱，相应收集活性蛋白峰，经90％硫酸铵盐析，透析、浓缩干燥获得白芸豆a-淀粉酶抑制剂产品。
(1)、白芸豆中的a-淀粉酶抑制剂DEAE离子交换柱层析使用DEAE-Celluluse作为分离纯化的离子交换介质，树脂预处理方法为：DEAE-Celluse用蒸馏水浸泡过夜，以去除过细部分，用0．5mol ／mLNaOH浸泡1~2h后转移到布氏漏斗中抽滤，用蒸馏水抽洗至中性，然后用0．5mol／mLHCl浸泡0．5h，用蒸馏水抽洗至中性，再用0．5mol ／mLNaOH浸泡0．5～111，蒸馏水洗至中性备用。
用前用0．02mol／LpH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，采用湿法装柱。
取过60目筛的白芸豆籽粒粉碎原料1009，按料液比(W／V)1：6加入1．5％NaCl溶液浸提过夜，离心(10 000rpm，20min 4℃)取上清70"C 水浴15min，冷至室温后离心，上清液加70％乙醇4℃醇沉，离心后收集沉淀。
称取白芸豆a-淀粉酶抑制剂粗品0．59，透析后溶于20mL0．02mol ／LpH6．5的醋酸．醋酸钠缓冲液中，上柱。
用0．02mol／LpH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液(含0-4)．3mol／LNaCl)梯度洗脱，洗脱流速6mL／h，5mL／管。
逐管检测A290和a-淀粉酶抑制剂活性。
收集蛋白峰和抑制活性峰相吻合的洗脱液，90％硫酸铵盐析，透析、浓缩干燥得白芸豆a-淀粉酶抑制剂样品。
（2）、使用Sephadex G．75凝胶预处理方法为：Sephadex G．75凝胶蒸馏水浸泡溶胀24h，用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复浸泡3-4次，并抽滤脱气。
操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。
置于蒸馏水中备用，使用前经0．02mol ／L pH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，采用湿法装柱。
实验中自芸豆a-淀粉酶抑制剂粗品经过DEAE．Celluse离子交换树脂柱层析后进行Sephadex G．75凝胶柱层析，用0．02mol／L pH6．5的醋酸-醋酸钠缓冲液梯度洗脱，洗脱流速4mL／h，5mL／管。
逐管检测A280和a-淀粉酶抑制剂活性。
收集蛋白峰和抑制活性峰相吻合的洗脱液。
2、白芸豆中a-淀粉酶抑制剂糖蛋白超滤提取工艺研究超滤是膜分离技术的一种，它是基于筛分原理即膜孔尺寸的大小对不同大小的物质进行分离、浓缩。
超滤膜是一种压力驱动膜，可以截留分子量在500-50000之间的物质，由于其操作环境温和等特点，对于热敏的酶、蛋白质等物质的分离有着独特的优点。
随着膜科学技术的发展，膜分离技术在蛋白质浓缩中得到了越来越广泛的应用。
陈全胜等[8]采用中空纤维超滤膜对菜籽饼粕中的蛋白质进行了分离研究，提出了超滤膜污染的预防及清洗方法，结果表明利用中空纤维膜分离菜籽饼粕中蛋白质的方法是可行的；杨国龙等[9]采用商业聚砜平板膜生产大豆浓缩蛋白，蛋白质含量由52％(干基)提高到72％(干基)，蛋白质回收率达到90％以上；井乐刚[10]研究了用超滤技术分离大豆乳清中的蛋白质和异黄酮的工艺条件，结果表明大豆乳清在超滤之前进行预处理可减轻膜污染，在合适的超滤条件下，大豆乳清中蛋白质的截留率为83．9％；程坷伟等人[11]研究了利用无机陶瓷膜提取甘薯淀粉生产废液中糖蛋白的超滤工艺，结果表明在最佳工艺条件下，糖蛋白溶液浓缩倍数为8．3倍，糖蛋白的截留率为91％，糖蛋白得率为73％。