三种染色方法观察骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态学特征潘源城;张信照;陈顺有【摘要】背景:国内外的研究表明,多种染色法联合应用有利于探究骨与软骨组织疾病的形态学表现.目前对于多种染色法探究骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态学表现研究较少.目的:通过苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色、Masson染色3种染色方法观察骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态表现.方法:SD大鼠40只由福建中医药大学实验动物中心提供,实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准.随机将40只SD大鼠分为2组:对照组不做处理;模型组建立胫骨近端骨骺损伤模型.分别于造模后1,7,28 d拍摄X射线片和7,28 d行MRI扫描;于造模后1,7,14,28 d麻醉大鼠后取胫骨损伤区组织,行苏木精-伊红染色、番红O-固绿染色、Masson染色,观察术后不同时间点生长板损伤区的组织形态表现.结果与结论:①X射线片显示:造模后1 d,胫骨干骺端骨骺损伤,软骨膜周围生长板间隙增宽;第7天,骨骺损伤处骨膜反应明显;第28天,骨膜反应消失,干骺端与生长板间隙关系基本恢复正常;MRI显示:造模后第28天MRI T2WI示骺板模糊,并可见一黑色线条形低信号影,提示骨桥形成;②造模后第1天,3种染色均可显示入侵的血管,Masson染色更为清晰;第7天:苏木精-伊红染色较番红固绿染色及Masson染色显示了损伤区软骨细胞的形态变化更加明显;第14天,番红O-固绿染色生长板与骨桥对比鲜明,Masson染色可观察到骨桥内尚未骨化的纤维血管组织;第28天,苏木精-伊红染色软骨细胞的周期性形态变化较明显,番红O-固绿染色骨桥和生长板形态分明,可清晰的表现损伤区生长板的压缩性改变;③结果说明,3种染色方法的联合应用能够全面、客观地探究骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态学表现.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)023【总页数】5页(P3649-3653)【关键词】染色方法;骨骺损伤;骨桥;骨膜;组织学;苏木精-伊红染色;翻红O-固绿染色;Masson染色【作者】潘源城;张信照;陈顺有【作者单位】厦门大学附属福州第二医院小儿骨科,福建省福州市 350007;厦门大学附属福州第二医院小儿骨科,福建省福州市 350007;厦门大学附属福州第二医院小儿骨科,福建省福州市 350007【正文语种】中文【中图分类】R446;R3180 引言 Introduction生长板是长骨内最薄弱的区域，也是最容易受损的区域，损伤的生长板常被骨组织修复而导致肢体的骨生长障碍和成角畸形[1-2]。
临床上常用Salter-Harris分型来推测和判断骨骺损伤的严重程度和预后，Salter-HarrisⅠ、Ⅱ型的骨骺损伤通常预后良好，而Ⅲ、Ⅳ骨骺损伤则容易造成生长板早闭、骨生长障碍[3]。
Basener等[4]对于儿童不同Salter-Harris分型的骨骺损伤进行了Meta分析，研究显示Salter-HarrisⅣ型骨骺损伤后更容易造成生长板早闭。
由于Salter-HarrisⅣ型的骨骺损伤累及了干骺端、生长板及骨骺，导致了垮生长板区域的骨桥形成，对生长板形成了纵向机械应力，抑制了骨的纵向生长。
关于骨桥形成的原因，相关的研究表明骨桥的发生与生长板损伤区的直接(膜内化骨)和间接的(软骨内化骨)骨形成机制有关，而新生血管的侵袭则是骨桥形成的先决条件[5-6]。
为了进一步探究骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态学表现，实验通过建立SD大鼠胫骨近端骨骺损伤模型，以3种染色方法来观察胫骨近端骨骺损伤后不同时间点生长板损伤区形态学表现。
1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计形态学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2018年7至12月在福建中医药大学完成。
1.3 材料1.3.1 实验动物清洁级雄性4周龄SD大鼠40只，体质量(120±5)g，由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(闽)2014-0005。
1.3.2 实验材料及试剂克氏针(直径1.0 mm，上海强生医疗器材有限公司)、X光机(西门子医疗系统有限公司)、7.0T小动物磁共振仪(Pharmascan，micro MRI，Bruker，Germany)、苏木精(G1080，北京索莱宝科技有限公司)、伊红(G1100，北京索莱宝科技有限公司)、番红O-固绿染色液(DB0082，北京雷根生物技术有限公司)、Masson三色法染色液(G1340，北京索莱宝科技有限公司)。
1.4 实验方法1.4.1 大鼠胫骨近端骨骺损伤模型建立 4周龄SD大鼠40只，随机分成模型组(n=20)和对照组(n=20)，对照组不做处理，模型组采用异氟烷吸入麻醉，取右侧胫骨，常规碘伏消毒手术区皮肤，沿胫骨前内侧取5 mm竖直皮肤切口，切开皮下肌肉组织，注意避免损伤膝内侧副韧带，暴露胫骨近端，用直径1.0 mm克氏针插入生长板，造成骨骺损伤[7-8]。
分别于术后1，7，14，28 d从2组大鼠各随机选取5只麻醉取材，以40 g/L多聚甲醛固定48 h后于10% EDTA(pH 7.2)中脱钙，每48 h更换1次脱钙液，脱钙完全后常规脱水，石蜡包埋。
1.4.2 损伤后生长板修复的影像学观察大鼠损伤侧胫骨在造模后第1，7，28天拍摄X射线片，造模后第7，28天行MRI扫描，观察损伤后生长板的修复情况。
1.4.3 组织学染色(1)苏木精-伊红染色：取大鼠胫骨损伤区的组织，行4 μm厚度切片，60 ℃烤1 h；脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min；体积分数100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min；超纯水Ⅰ、Ⅱ各5 min；苏木精1 min，稍水洗；流水反蓝5 min伊红30 s，稍水洗；晾干，中性树脂封固。
(2)番红O-固绿染色：取大鼠胫骨损伤区的组织，行4 μm厚度切片，60 ℃烤1 h；脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min；体积分数100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min；超纯水Ⅰ、Ⅱ各5 min；A液(A1∶A2=1∶1)4 min；酸性乙醇15 s，蒸馏水洗1 min；固绿90 s，蒸馏水洗1 min；番红2 min，蒸馏水洗1 min；乙酸1 min，蒸馏水洗1 min；晾干，中性树脂封固。
(3)Masson三色法染色：取大鼠胫骨损伤区的组织，行4 μm厚度切片，60 ℃烤1 h；脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min；体积分数100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min；超纯水Ⅰ、Ⅱ各5 min；铁苏木素(A1∶A2=1∶1)7 min，稍水洗；酸性乙醇15 s，稍水洗；Masson蓝化液3 min；蒸馏水洗1 min；丽春红品红染色液5 min；弱酸工作液洗1 min(超纯水∶弱酸=2：1)；磷钼酸溶液洗2 min；弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色液90 s；弱酸工作液洗1 min；晾干，中性树脂封固。
1.5 主要观察指标①损伤后生长板修复的影像学表现；②损伤后生长板修复的形态学表现。
2 结果 Results2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠40只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 损伤后生长板修复的影像学表现见图1。
2.2.1 X射线造模后1天，X射线片示胫骨干骺端骨骺损伤，软骨膜周围生长板间隙增宽；造模后第7天，X射线片示骨骺损伤处骨膜反应明显；术后第28天，X射线片示骨膜反应消失，干骺端与生长板间隙关系基本恢复正常。
2.2.2 MRI 造模后第7天MRI，T2WI示生长板稍高信号影，生长板内侧间隙增宽；造模后第28天MRI，T2WI示骺板模糊，并可见一黑色线条形低信号影，提示骨桥形成。
2.3 损伤后生长板修复的形态学表现造模后第1天：生长板损伤区两侧血管侵入吻合，可见大量炎性细胞及红细胞增生，见图2。
3种染色均可显示入侵的血管，但Masson染色更为清晰的显示了入侵的血管形态。
造模后第7天：纤维血管桥形成，损伤侧生长板增宽并向下延伸侵入干骺端，损伤区新生的生长板软骨细胞排列紊乱，见图3。
苏木精-伊红染色较番红固绿染色及Masson染色而言，更为明显的显示了损伤区软骨细胞的形态变化。
造模后第14天：损伤侧生长板持续性增宽，生长板损伤区骨质浸润明显，骨桥形成，见图4。
番红O-固绿染色下生长板与骨桥对比鲜明，而通过Masson染色则可观察到骨桥内尚未骨化的纤维血管组织。
造模后第28天：骨桥重塑，损伤区主要由新生骨构成，骨髓和骨小梁形成良好，见图5。
苏木精-伊红染色对软骨细胞的周期性形态变化显示较为明显，番红O-固绿染色使骨桥和生长板形态分明，清晰的表现了损伤区生长板的压缩性改变。
3 讨论 Discussion生长板又称骺板，位于长骨的干骺端与骨骺之间，它通过严格调控生长板软骨细胞的增殖、成熟和细胞外基质的分泌，负责长骨的纵向生长[9-10]。
生长板是长骨内最脆弱的部位，也是最容易受损伤的部位，且生长板软骨再生能力有限，损伤后易导致肢体的生长障碍。
研究表明，大鼠胫骨近端骨骺损伤后生长板的修复机制与骨折愈合过程的骨形成机制相似，均经历了4个损伤反应阶段，分别是发生在第1-3天，第3-7天，第7-14天，第10-25天的炎症反应、纤维化反应、成骨反应、骨桥成熟重构反应[1，11]。
这种骨折愈合机制是相当复杂的，涉及到一种结缔组织到另一种结缔组织的顺序变化[12]，软骨形成于骨折间隙，骨折间隙钙化，未成熟骨取代，然后被重塑成成熟的骨骼。
以克氏针钻孔损伤生长板建立骨骺损伤模型，虽然仅类似于Salter-Harris Ⅳ型骨骺损伤，无法真正模拟外伤性骨骺损伤，但能够通过组织学染色方法，良好的呈现骨骺损伤后骨桥形成过程的组织形态学表现。
图1 大鼠胫骨骨骺损伤后生长板修复的影像学表现(箭头指损伤区) Figure 1 Imaging manifestations of growth plate repair after tibial epiphyseal injury in rats (arrows indicate injury site) 图注：图A-C为造模后第1，7，28天X射线片；D，E为造模后第7，28天MRI。
X射线片显示：造模后第1天，胫骨干骺端骨骺损伤，软骨膜周围生长板间隙增宽；第7天，骨骺损伤处骨膜反应明显；第28天，骨膜反应消失，干骺端与生长板间隙关系基本恢复正常；MRI显示：造模后第28天T2WI示骺板模糊，并可见一黑色线条形低信号影，提示骨桥形成。
图2 大鼠造模后第1天损伤区组织3种染色结果(×100) Figure 2 Histological results in the damage area in rats by three staining methods at 1 day after modeling (×100) 图注：3种染色均可显示入侵的血管，Masson染色更为清晰。