骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua【摘要】目的探讨骨髓活检组织行EBV encoded RNA(EBER)原位杂交检测的影响因素,优化检测条件以期提高骨髓活检组织中EB病毒的检出率.方法收集35例EB病毒相关疾病的骨髓活检标本,通过对比实验,比较不同脱钙方法、不同蛋白酶K 消化条件、不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的切片质量、脱片率及染色质量情况.结果脱钙以运用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h最佳;蛋白酶K消化时间为9min的组织切片脱片率低,杂交效果最好,阳性细胞着色深,定位准确;在37℃条件下进行抗体孵育杂交染色质量为佳.结论选取合适的脱钙方式,延长蛋白酶K消化时间,选择最佳抗体孵育温度,可降低脱片率,显著提高骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的染色质量,为EBV相关疾病的诊断和鉴别诊断提供重要依据.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2019(028)002【总页数】5页(P162-166)【关键词】骨髓活检组织;EBER;原位杂交;影响因素【作者】Zheng Jie;Fang Qingquan;Tu Jinhua【作者单位】;;【正文语种】中文【中图分类】R329.3EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）编码的小RNA，该病毒不仅广泛潜伏于健康人群，而且是一些非肿瘤疾病如传染性单核细胞增多症等的病因。
更重要的是，EB病毒与越来越多的肿瘤性疾病密切相关[1，2]。
EBER原位杂交法因其准确的定位、极高的特异性和灵敏性已成为公认的EB 病毒标准检测方法，并作为病理辅助诊断的重要依据之一在日常工作中应用越来越广泛。
由于原位杂交检测步骤多，容易受各种因素（如组织标本的预处理、标本类型、酶的消化程度、杂交后洗涤等）的影响。
在临床实际工作中对骨髓活检组织行EBER原位杂交检测时，常因组织脱片或者染色结果不稳定需要进行重复实验。
为此，本研究通过实验，从脱钙方法、蛋白酶K消化时间、抗体孵育温度三个影响因素进行优化，摸索较佳的检测条件。
材料与方法1 标本来源收集厦门大学附属第一医院病理科2014年5月—2018年5月间确诊为EB病毒相关疾病且标本类型为骨髓活检组织的病例35例。
其中NKT细胞淋巴瘤18例，EBV相关淋巴组织增殖性疾病17例。
所有标本均经l0%中性福尔马林固定不少于6h。
2 设备与试剂设备：原位杂交仪为Thermo BriteTM公司S500-24 型；试剂：原位杂交检测试剂盒购自福建泰普公司。
脱钙液的配置：①10%硝酸脱钙液：硝酸10ml加入90 ml蒸馏水；②强酸混合脱钙液配制方法：10%中性福尔马林500ml与95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后缓慢加入浓盐酸150ml；③ 改良EDTA脱钙液配制方法：250g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸盐缓冲液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后加入适量氢氧化钠（NaOH），将pH值调到7.0左右[3]。
3 方法3.1 脱钙方法及脱钙终点的判定将选取的35例标本每例分为三段，分别放入三种不同的脱钙液室温下进行脱钙：A组用10%硝酸脱钙液脱钙1～1.5h后取出流水冲洗30min；B组用强酸混合脱钙液脱钙2-3h后流水冲洗30min；C组用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h。
骨髓组织浮起，以尖镊探测骨髓活检组织变软或大头针能轻松刺入组织视为脱钙完成[4]。
3.2 不同脱钙液脱钙后的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测①组织脱水与制片：将脱钙完成后的A、B、C三组骨髓活检标本放入自动脱水机中脱水、透明、浸蜡，包埋。
制片时将组织粘附于APES处理的防脱载玻片，厚度为3μm，60～70℃烤片1h，脱蜡。
②蛋白酶K消化：甩干切片，将组织周围液体用滤纸擦干，滴加蛋白酶K与PBS按1×25比例配制的酶工作液，室温孵育5min，蒸馏水洗1×1min。
③杂交:滴加20μl探针/切片，加盖玻片，原位杂交仪55℃变性 60～90min，37℃杂交 4～16h。
48℃ PBS 缓冲液浸泡，移去盖玻片后PBS继续浸泡洗涤3×5min。
④信号放大和显色: 每张切片分别滴加地高辛染色液试剂A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；试剂B室温孵育30min，PBS浸泡3×2min；试剂C室温30min，PBS浸泡3×2min，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。
比较A、B、C三组的脱片率、切片质量、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。
3.3 不同蛋白酶K消化时间的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测将C组用改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片3片，厚度3μm，随机抽取组成D、E、F四组，分别进行5min、9min、13min间隔4min的梯度消化，其余操作步骤同C组，比较D、E、F三组的脱片率、杂交阳性信号的定位与强度、背景清晰度。
3.4 不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测将C组改良EDTA脱钙液脱钙的组织蜡块进行连续切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分两组进行对比实验。
G组：滴加试剂A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加试剂B室温孵育20min，滴加试剂C室温孵育 30min；F组：试剂A孵育30min、试剂B孵育20min、试剂C 孵育30min均在37℃水浴箱中进行，比较G、F两组杂交阳性性号的定位与强度、背景清晰度。
4 EBER原位杂交的判读与染色质量评估标准细胞核棕黄色为阳性着色，胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有见核分裂时可以出现胞浆阳性着色[5]。
设定组织脱片率、切片质量、杂交阳性信号的位置与强度、背景是否清晰有无黄染四项为评价指标，评分标准为：①切片质量（100分）：切片时组织相对较软，基本能完整切片，不影响诊断，减1～10分；切片时感觉较硬，部分有沙粒感，切片不够平整，不影响诊断，减11～30分；切片时刀片磨损严重，肉眼可见明显刀痕，组织皱缩，无法制成完整切片，影响诊断，减31～100分。
②杂交阳性信号的定位与强度（100分）：阳性信号定位准确，着色较淡，低倍镜下可分辨，不影响诊断，减1～10分；阳性信号定位较准确，着色低倍镜下不易观察，需转换至高倍镜下仔细辨认，不影响诊断，减11～30分；阳性信号定位不准确，着色太弱，无法准确判读，减31～100分。
③背景清晰度（100分）：阳性与阴性细胞对比鲜明，杂交背景轻微黄染，不影响诊断，减1～10分；阳性与阴性细胞对比度不佳，杂交背景出现不同程度黄染，但仍可作出诊断，减11～31分，杂交背景黄染严重，影响诊断，减31～100分。
由2名经验丰富的病理医生阅片进行双盲评分，每项指标数据为评分的均值。
5 统计学分析应用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料采用率的比较，采用χ2 检验，计量资料采用均数±标准差(¯x±s)表示，用配对t检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响A、B、C三组切片原位杂交染色质量结果比较见表1。
比较三组脱片率显示，A组（42.9%）的脱片率明显高于B（14.3%）、C（11.4%）两组的脱片率，差异有统计学意义（P均＜0.01）。
用三种脱钙液脱钙的骨髓活检组织基本均能完整切片，A组切片时部分会有沙粒感，肉眼可见明显刀痕，B、C两组切片时组织相对较软，更易切片。
杂交阳性信号定位与强度得分C组均显著高于A、B两组，A组原位杂交染色阳性细胞定位较模糊，信号弱甚至不显示，B组阳性细胞定位准确，可是阳性信号的强度不如C组。
三组背景染色均较清晰，差异无统计学意义。
比较A、B、C三组原位杂交染色质量（图1）可见用改良EDTA脱钙液脱钙的骨髓活检标本行原位杂交染色效果最好。
2 不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响比较D、E、F三组脱片率，F组（42.9%）明显高于D组（8.6%）和E组（14.3%）（P＜0.01）。
D、E、F三组杂交阳性信号的定位与强度得分分别为67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 组与 E、F 组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。
D、E、F三组背景清晰度指标得分为84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F组蛋白酶K消化时间长，背景出现不同程度黄染，与D、E组相比差别有统计学意义（P＜0.01）。
比较E、F三组原位杂交染色质量（图2）可见消化时间为9min组的切片，杂交效果最好，阳性细胞着色深，定位准确，背景干净，结果清晰易辨。
图1 不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响。
A，A组组织脱片严重，阳性细胞信号不显示；B，B组组织轻微脱片，阳性信号定位准确，信号较弱；C，C组组织无脱片情况，阳性信号定位准确，阳性信号强；比例尺，50μm。
Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm3 不同抗体孵育温度对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响G、F组杂交阳性信号定位与强度得分分别为79.3±0.8、89.2±0.5，差异有统计学意义（P＜0.01），背景清晰度得分分别为89.2±0.5、82.2±0.5，差别无统计学意义。