指标:1、品质指标硬度、色泽、褐变指数、失重率、腐烂率、可溶性固型物、呼吸强度、乙烯释放率、可滴定酸、Vc2、抗性指标抗氧化衰老的有:SOD CAT APX GSH MDA 原果胶(可溶性果胶)抗病相关指标有:PPO POD CHT GUL PAL总酚类黄酮木质素3、测定方法:褐变指数色泽失重率腐烂率呼吸强度乙烯释放率硬度可溶性固型物可滴定酸:试剂:0.1mol/L NaOH(4g纯+1000ml蒸馏水,邻苯二甲酸氢钾标定) 1%酚酞试剂(1g酚酞加入到100ml50%的乙醇溶液中溶解)方法:1、NaOH的标定:准确称取105℃下烘干至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.6g ,加入50ml新煮沸过的冷水,振摇,使其尽量溶解,再滴加2滴1%酚酞指示剂,用配置的NaOH溶液标定,滴定至溶液呈粉红色。
每1mlNaOH相当于20.42mg邻苯二甲酸氢钾,计算出NaOH滴定液的浓度。
2、测定步骤:称10g苹果,研磨,转移到100ml容量瓶中,蒸馏水洗研钵3次再定容,摇匀,静置30min后过滤。
吸取20ml滤液,转入三角瓶中,加入两滴1%酚酞试剂,用已标定的氢氧化钠溶液进行标定,滴定至溶液初现粉色并30秒内不退色为终点(PH8.1-8.3),重复三次,再用蒸馏水作为滤液进行滴定作为空白对照。
可定丁酸含量=【样品提取液总体积*氢氧化钠滴定液浓度*(滴定滤液消耗的氢氧化钠体积—滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积)】/(滴定时所取滤液体积*样品质量)Vc:试剂:5%钼酸铵溶液(称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中,并定容至100ml)草酸-EDTA 溶液(称取 6.3g草酸和0.75g EDTA-Na2溶于蒸馏水中并定容至1000ml)5%H2SO4(体积分数) 偏磷酸-乙酸溶液(取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸48ml,溶解后加蒸馏水稀释至100ml,必要时过滤,在冰箱中可保存3天)Vc标准溶液(称取Vc100mg,置100ml容量瓶中,加适量草酸-EDTA溶液溶解后,在用该溶液定容到100ml,即成1mg/ml标准液,此溶液随配随用(如果纯度不够应进行标定))提取及测定:1、制作标准曲线: 7支25ml具塞试管,按下表加入各种试剂试剂试管号1 2 3 4 5 6 7Vc标准液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 草酸EDTA溶液/ml 5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 偏磷酸-乙酸溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1:19H2SO4/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5%钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Vc含量/mg 0 10 20 40 60 80 100 加完试剂摇匀后,置30℃水浴中保温15min,用蒸馏水稀释至25ml,混匀,用1号空白管调零,在760nm波长下比色,记录吸光度,以Vc含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
2、提取及测定:称取5g果蔬组织,加5ml草酸-EDTA溶液研磨成匀浆,并仔细转入25ml容量瓶中,再用提取介质冲洗研钵,冲洗液一并倒入容量瓶中。
取一部分匀浆液经3000g离心10min后,取1ml上清液与标准管同法测定,若样品显色液中出现沉淀,可过滤后进行比色,不影响测定结果。
计算公式:Vc含量(mg*100g-1FW)=标准曲线上查的的Vc的量*样品提取液总体积/(测定时所用样品液体积*样品鲜重)注意:显色温度和加入显色剂后的时间要一致。
GSH:试剂:50g/L三氯乙酸(5g三氯乙酸和蒸馏水溶解稀释至100ml,再加入186mg EDTA-Na2.2H2O)0.1mol/LPH7.7磷酸钠缓冲液和0.1mol/LPH6.8磷酸钠缓冲液4mmol/L二硫代硝基苯甲酸(15.8mg DTNB,用0.1mol/L、PH6.8磷酸缓冲液溶解,定容至10ml,摇匀,4℃保存)100umol/L还原性谷胱甘肽标准液(3g还原型谷胱甘肽加入少量无水乙醇用蒸馏水定容至100ml)实验步骤:1、标准曲线制作:取六只试管编号,按下表加入各种试剂,混匀,于25℃保温反应10min,以0号管为参比调零,测定显色液在波长412nm处的吸光度值,以吸光度值为纵坐标,还原型谷胱甘肽为横坐标,绘制标准曲线。
项目管号0 1 2 3 4 5 还原型谷胱甘肽标液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 PH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于还原型谷胱甘肽物质的量/umol 0 20 40 60 80 100 2、提取和测定:5g果实加入经预冷的三氯乙酸,在冰浴下研磨匀浆,于4℃、12000xg离心20min,收集上清液测定。
取一只试管,依次加入1ml蒸馏水、1mlPH7.7磷酸缓冲液和0.5mlDTNB,混匀即为绘制标准曲线的0号管溶液,此液作为参比调零。
另取两支试管,分别加入1ml上清液、1mlPH7.7磷酸缓冲液,然后向一只管中加入0.5mlDTNB,向另一支管中加入0.5mlPH6.8磷酸缓冲液。
将两只管置于25℃下保温反应10min,迅速测定显色液在波长412nm下的吸光度值,分别记作ODs和ODc。
重复三次。
根据ODs-ODc的差值从标准曲线上查的还原型谷胱甘肽含量,计算每克果实中还原型谷胱甘肽的含量:还原型谷胱甘肽含量=(标准曲线上查得的值*样品提取液总体积)/(吸取样品液体积*样品质量)注意:先做样品本底对照。
MDA:试剂:100g/L三氯乙酸(称取10g三氯乙酸蒸馏水溶解稀释至100ml)6.7g/L 硫代巴比妥酸(称取0.67g硫代巴比妥酸,用100ml0.05mol/L氢氧化钠溶解)测定步骤:称取1g果蔬样品,加入5ml三氯乙酸溶液,研磨匀浆于4℃10000g 离心20min,收集上清液低温保存备用。
取2ml上清液,对照空白管中加入2ml 三氯乙酸代替提取液,分别加入2ml0.67%硫代巴比妥酸,混合后在沸水浴中煮沸20min,取出冷却后再离心一次,分别测定上清液在450nm、532nm、600nm波长处的吸光度值,重复三次。
计算:丙二醛含量(umol/L)=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450每克果蔬中丙二醛的含量=丙二醛含量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量*1000) 注意:出现负值,表明糖的影响很大,需做预实验确定适宜的条件。
原果胶(可溶性果胶):试剂:1.5g/L咔唑-乙醇溶液(称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100ml)100ug/ml半乳糖醛酸标准液(称取10mg半乳糖醛酸M=194,用蒸馏水溶解定容至100ml)浓硫酸95%乙醇0.5mol/L硫酸溶液测定步骤:1、制作标准曲线:取6支25ml具塞刻度试管,编号,按下表加入半乳糖醛酸标准液,然后小心地沿管壁加入6ml浓硫酸,在沸水浴中加热20min,取出冷却至室温后,各加入0.2ml1.5g/L咔唑-乙醇溶液,摇匀,在暗处放置30min 后,测定反应液在波长530nm处的吸光度值,并以吸光度值为纵坐标,半乳糖醛酸质量(ug)为横坐标,绘制标准曲线求出方程。
项目管号0 1 2 3 4 5半乳糖醛酸标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 相当于半乳糖醛酸的量/ug 0 20 40 60 80 100 2、提取测定:(1)可溶性果胶提取:称取1g果蔬组织,研磨成匀浆转入50ml刻度离心管中,加入25ml95%乙醇,在沸水浴上加热30min,以除去样品中糖分及其他物质,注意在煮沸过程中要及时补加95%乙醇。
取出冷却至室温,于8000r/min离心5min,弃去上清液,再加入95%乙醇在沸水浴上加热,如此重复3-5次。
然后将沉淀放入试管中,加入20ml蒸馏水,在50℃水浴中保温30min,以溶解果胶。
取出冷却至室温后,于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中,用少量水洗涤沉淀,离心后一并将上清液移入容量瓶中,加蒸馏水至刻度,此溶液即为可溶性果胶。
(2)原果胶提取:将上述遗留的沉淀物,保留在刻度离心管仲,再向其中加入25ml0.5mol/L硫酸溶液,在沸水浴中加热1h以水解原果胶,取出冷却至室温后,于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,此为原果胶测定液。
(3)测定:吸取1ml提取液,加入到25ml刻度试管中,按标准曲线的操作步骤进行测定,重复三次。
计算:根据吸光度值查得半乳糖醛酸质量,计算每克果蔬中果胶含量,以半乳糖醛酸质量分数表示。
半乳糖醛酸含量=查得的半乳糖醛酸量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量) 注意:检验糖分是否除尽的方法:取0.5ml提取液置于试管中,加入2-3滴50g/Lα-萘酚的乙醇溶液,充分混合,此时溶液稍有白色沉淀,然后使试管稍稍倾斜,用吸管沿管壁加入1ml浓硫酸(注意水层与硫酸层不可混合)。
待试管静置后,若在两层的界面上产生紫红色环,则证明提取液中含有糖分总酚:试剂:钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸锂(Li2SO4)、磷酸(H3PO4≥85%)、磷钼酸(24MoO3·P2O5·xH2O)、碳酸钠(Na2CO3)、盐酸和溴水为分析纯。
一水合没食子酸标样为Sigma -Aldrich 公司产品。
水为蒸馏水。
1.1.2 FC 显色剂:称取50.0 g 钨酸钠和12.5 g 钼酸钠, 用350 mL 蒸馏水溶于1 000 mL 回流瓶中, 加入25 mL 磷酸和50 mL 盐酸, 混匀, 微沸回流2 h, 加入75.0 g 硫酸锂、25 mL 蒸馏水和数滴溴水, 开口沸腾约15min( 至溴水挥尽为止) , 冷却, 定容至500mL,过滤, 置棕色瓶中保存备用。
使用时加入1 倍蒸馏水稀释。
1.1.3 FD 显色剂:称取100.0 g 钨酸钠和20.0 g 磷钼酸, 溶于200 mL 蒸馏水, 加入50 mL 磷酸, 加热回流2 h, 冷却, 定容至1 L。
1.1.4 7.5%碳酸钠溶液:称取37.5 g 碳酸钠, 溶于250 mL 温水, 混匀, 冷却, 定容至500 mL。
1.1.5 一水合没食子酸标准溶液:称取0.110 g 一水合没食子酸, 用蒸馏水溶解、定容至100 mL, 此溶液质量浓度为1 000 mg/L。