柠檬酸液态发酵及提取工艺0802班生物科学饶慧（指导教师：胡远亮）0前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。

极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。

柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。

柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。

柠檬酸循环(citric acid cycle)又称三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)，克雷布斯循环(Krebs cycle)。

体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。

通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。

实验发酵机理：1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。

2）黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。

3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。

Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。

发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。

固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。

采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。

液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。

发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。

深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。

微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。

现多采用通用发酵罐。

它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。

发酵罐径高比例一般是1:2.5 ，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。

除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。

我国柠檬酸的生产现状：我国是世界柠檬酸生产大国，总产量居世界前列。

近年来，由于我国柠檬酸生产能力和出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重供大于求局面。

我国柠檬酸生产以薯干为原料的深层发酵技术具有独创性，发酵指数处世界前列，产品在国际市场具有一定竞争力。

但我国提取工艺和设备水平落后，生产单耗高，收率低，产品质量不高，规模效益差，深度产品开发少，废渣废水污染严重。

针对这些问题，国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，也有大量的研究探究了柠檬酸生产废渣栽培平菇厌氧发酵生产沼气制取糖化酶等综合利用、废水循环利用和治理等。

柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。

一般认为，黑曲霉适合在28～30 ℃时产酸。

温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。

微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH 为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。

通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。

随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。

采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。

柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。

1材料与方法1.1材料菌种：黑曲霉，来自黄石市兴华生化有限公司；原料：玉米粉、蔗糖；试剂：α-淀粉酶、琼脂、碳酸钙、硫酸、0.1429 mol/L NaOH、DNS等。

1.2 仪器设备试管、三角烧瓶、茄子瓶、培养皿、1 mL吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、天平、灭菌锅、培养箱、摇床、小型板框过滤机、恒温水浴锅、搅拌机、离子交换柱、旋转蒸发器、恒温干燥箱。

1.3培养基斜面种子培养基（马铃薯琼脂培养基）：去皮马铃薯200 g切成小块，加水约500 mL，煮沸30 min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20 g，琼脂20 g．溶化后自来水定容至1000 mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20 min，取出摆斜面；马铃薯液体培养基：同马铃薯琼脂培养基的制作，但不加琼脂，25 ml/250 ml三角瓶分装，121℃灭菌20 min；种子与发酵培养基。

1.4种子制备(1) 接种：用无菌水将麸曲孢子制成孢子悬液，按1‰接种于摇瓶中；一支斜面接4～5瓶；(2) 摇瓶培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，38℃，100 r/min培养20 h；或35℃下、转速200 r/min( 24 h前l00，24 h后200 r/min)、300 r/min( 24 h前l00，24 h后300 r/min) ，培养3～4 d；(3) 镜检：显微镜观察，处于快速生长期，可用于接种。

1.5发酵液预处理(1) 取60目以上的玉米粉500 g装入2000 mL烧杯中，加1000 mL水以及7-8单位的α-淀粉酶/g玉米粉，于80℃消化10 min；(2) 继续加热至90℃保持30 min，碘检不变色后，加热到100℃煮沸10 min，趁热两层纱布过滤；(3) 滤液加水冷却并调整糖度至15%-20%和蛋白质含量不超过4 g/L，最后调整pH 为6.0 ；(4) 然后用500 mL三角瓶按每瓶50 mL分装，瓶口塞入8层纱布包扎好，121℃灭菌20 min。

1.6发酵(1) 第一阶段：前24 h，温度32～35℃，转速100 r/min ；(2) 第二阶段：24 后，温度35℃，转速200 r/min；(3) 发酵0、24、48、72、96 h取样，0 h样品直接取1瓶作对照，并从中取10 ml 冷冻保存。

其它时间取样时，每个样品仅取1 ml冷冻保存，取样时用试纸现场检测pH值。

1.7发酵过程及分析(1) 样品80℃水浴30 min，3000 r/min，10 min离心去掉菌体等杂质，收集上清，检测残糖和柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。

如果检测样品量不够，可对上清进行适当倍数稀释；(2) 柠檬酸含量检测：一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429 mol／L NaOH溶液滴定发酵过滤清液；(3) 总糖及残糖(还原糖)测定：采用DNS法。

1.8柠檬酸提取(1) 过滤：加热至65±2℃，3 层纱布过滤，可用少量75±2℃水洗；取滤液。

(2) 中和：利用柠檬酸钙难溶于水的特点，与残糖以及蛋白质、金属离子等杂质分离的过程，加热至70-75℃，加入碳酸钙中和至pH6.1；(3) 过滤、洗糖：真空抽滤，90℃热水洗至无糖。

2 结果与分析2.1种子的制备将黑曲霉菌种接种于2支土豆斜面培养基3 d后观察到培养基上生长出能够产生黑色孢子的黑曲霉，然后分别接种于已灭菌的5瓶分装有25 mL/250 mL土豆液体培养基中，摇床培养。

表2.1.1 发酵过程中培养基的变化情况发酵时间（h）培养基变化情况0液体较澄清、透明24液体变化不大48液体浑浊有沉淀产生72液体较浑浊不透明96液体中有成团的沉淀末液体高度浓缩结果液体较培养前浑浊，镜检观察到了球形孢子，但数量不是很多，且没有杂菌生长。

2.2发酵液预处理发酵液预处理时用碘液检查发现碘液变蓝，说明发酵液中还有淀粉的存在，可能的原因是α-淀粉酶的活性低因而转化速率较慢；再加入一定量的α-淀粉酶继续处理5 h后碘液未变蓝，说明玉米中的淀粉完全转化为糖。

纱布过滤于烧杯中，并重复过滤几次，用糖度计测量含糖量为14.2 g/100 ml、14.5 g/100 ml，经滤纸过滤后的清夜含糖量为12.4 g/100 ml，经计算加入蔗糖调至15 g/100 ml过夜培养。

2.3pH值变化在发酵过程中，每隔24 h测定一次pH值，以确定发酵的终点。

表2.3.1 pH值变化发酵时间（h）培养瓶编号及pH值0 3(6.0) 5(6.0) 10(6.0)24 2(5.5) 8(6.0 ) 18(6.0)48 9(5.0) 17(5.0) 24(5.0)72 7(4.4) 12(4.6) 16(4.8)96 4(3.8) 11(3.6) 22(4.0)末4(3.0) 17(2.5) 20(4.0)从表中可以看出，随着时间的推移，pH下降，说明菌在持续产酸。

实际的发酵时应当在pH下降到1.5以下时加入少量的CaCO3以中和酸，保证黑曲霉的生长环境。

2.4柠檬酸含量测定结果通过每24 h取一次样，用NaOH进行酸碱滴定，计算获得柠檬酸的含量。

图2.4.1柠檬酸含量变化曲线由柠檬酸含量变化曲线可以看出，随着时间的推移，柠檬酸含量呈现上升的趋势。