实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
SYBR Green I SYBR Green 只有和双链 DNA结合后才发荧光； 变性时，DNA双链分开， 无荧光
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
热变性 引物退火
延伸反应
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起 始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时荧光定量PCR原理－－常用名词概念
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
实时荧光定量PCR原理－－扩增曲线
荧光基团
Rn（荧光强度）
Log－liner phase
Log－liner phase
荧光定量原理与分析方法
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
市场部产品经理 张嵘
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
实时荧光定量PCR原理－－定义
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析。
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量
En：扩增效率
Xn：第n次循环后扩增产物数量
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
在扩增产物达到荧光阈值时
XCt＝X0 *（1＋En）Ct＝M （1）
XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M
实时荧光定量PCR原理－－ Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
理想的PCR反应 Xn＝X0 * 2n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
方程式（1）两边同取对数得：
LogM＝LogX0 *（1＋En）Ct
（2）
整理方程式（2）：
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋En）
实时荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
Sample
Ck 104
Ck 102
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋En）
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少
非常灵敏 具有价格优势
容易与非特异性双链 DNA结合，产生假阳性。 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法
每扩增一条DNA分子释放 一个荧光信号，可以在 循环过程中任一点检测 荧光
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法 水解型杂交探针
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
环
茎
荧光素 淬灭剂
标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
FRET
实时荧光定量PCR的分类－－分子信标
优点
高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高
荧光检测元件
Baseline
Cycle（循环数）
实时荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光本 底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准 偏差的10倍
手动设置：大于荧光背景值 和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段
真正的信号：荧光信号超过 域值
绝对定量分析方法简介－－标准品的制备
绝对定量分析方法简介－－标准品的制备
倍比梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
拷贝数的计算
Rn（荧光强度）
Log－liner phase
Log－liner phase
Threshold
Baseline
Cycle（循环数）
实时荧光定量PCR原理－－Ct值
Rn（荧光强度）
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩 增产物的荧光信号达到 设定的阈值时所经过的 扩增循环次数
C(t) value Cycle（循环数）
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 ¾ SYBR Green I
特异性荧光标记 ¾ TaqMan Probe ¾ Molecular Beacon Probe
相对定量分析方法简介－－内参照
¾ GAPDH ¾ Beta-actin ¾ beta-2-microglobulin (B2M) ¾ ribosomal protein L13a (RPL13A) ¾ PPIA (Cyclophilin) ¾ ubiquitin C (UBC) ¾ eukaryotic translation initiation factors 4A (eIF4A) ¾ 18S rRNA ¾ ……
设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数
绝对定量分析方法简介－－实验例
绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行
Sample: HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml
实验数据：
copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 BLANK None None
Cycle number
Log浓度与循环数呈线性关系
Log of DNA concentration
实时荧光定量PCR技术的应用
定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等
绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等
相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因 芯片结果验证，差异显示结果验证等
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
绝对定量分析方法简介－－实验例
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe） 目录号（FP203） 设置对照：浓度为106、105 、104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA
绝对定量分析方法简介－－实验例
标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线
y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988
30
25
20
15 5×103
5×104
5×105
Copies
5×106
扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) ×100% =103%
只适合特定目标 传疾病的诊断
Molecular Beacon法
(分子信标)
高特异性 荧光背景低
价格高 设计困难 只适合特定目标
特定基因分析 SNP分析
内容概要
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝பைடு நூலகம்定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项
绝对定量分析方法简介－－绝对定量定义
不足点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
实时荧光定量PCR的分类——SYBR Green I染料法
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
¾ 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
¾ 4、其他与常规PCR相同
实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法
优点
缺点
高特异性 设计相对简单
(与目标序列某一区域互补) 重复性比较好
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准
品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
25
绝对定量分析方法简介－－绝对定量标准品
未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较