肌肉组织学常用测量指标及方法
一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）：（方法见附件一）
各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。
方法1――在10X 40倍显微镜下，用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。
参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。
先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径—反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。
方法2――以日本产MICRO-SCALE定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测
定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。
肌纤维的面积以“长径X短径X 0.7 ”的经验公式求得。
取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。
二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）：（方法见附件一）
在10X40倍显微镜下，随机选择视野，记录每个样本20束肌束内肌纤维根数, 求其平均值和标准误。
三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）
在10X40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。
四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）
在目镜中加入网格目测微尺，在10X 40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数，换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。
在选择视野时避开较大的肌束膜。
五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1――取染色的切片，用显微投影仪放大技术放大于白纸上，对3种组织绘出或打印，剪下分别称重并换算出其3种组织面积比。
方法2――采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。
在15X40倍显微镜下，每个样本取5个不同视野进行显微摄影，再将照片洗出（彩色5寸或更大）。
将所得照片按肌纤维与结缔组织分别剪下，用1/ 10000电子分析天平称重，分别得出肌纤维与结缔组织的重量。
由于相纸密度相同，所以此重量比能反映其面积和体积比。
六、肌节长度：
方法1——于新鲜肉样中心部位取3cm1左右的一小块与20ml的0.08mol/L KCl 溶液混合,于高速组织捣碎机中均质30s,制压片一张,用相差显微镜10X 100 倍显微测量肌节长度，每个样本随机测定20根肌原纤维的肌节，其平均值代表该肌肉样本的肌节长度。
方法2——电子显微镜超微结构观察：新鲜取样约1 cm X 1.5cm,置于2.5%戊二醛溶液中预固定，用眼科剪刀剪切成 1 cm3大小，放在戊二醛溶液中继续固定，经PBS冲洗后用1%的锇酸固定2.5小时，梯度丙酮脱水（50%, 70%, 85%, 90%, 100%）, Epon-812树脂包埋。
超簿切片机切成50nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬
酸铅染色，透射电镜（1-4万倍）观察、拍照、冲洗印相，用游标卡尺测量肌节长度、肌原纤维直径，I带及A带长度，并观察肌纤维超微结构的特征，肌纤维间线粒体、肌糖元、脂肪滴的含量。
（我校为70-80元/张，只需要采样后交给电镜室即
可。
）
附件一：
一、肌纤维石蜡组织切片的制作（H.E）
（注：组织片主要由切片、整装片和涂片三种方法制成；切片包括：石蜡切片法、火棉胶切片法和冰冻切片法等。
）
1■取材和固定：在猪屠宰后1小时内切取最后胸椎处眼肌中部1 x 1 x2CM肌肉组织块（动作要轻，不要挤压，以免内部结构变形），准确标号后置于10%甲醛水溶液中固定保存。
如血污太多，则用生理盐水（0.9%Nacl溶液）漂洗干净之后再固定。
2■洗涤：在脱水前用自来水冲洗样品，时间不超过24小时。
3■脱水：将洗好后的样品放入为70%、80%、90%、100%（无水酒精）、100% （无水酒精）的酒精中分别经过夜、8小时、8小时、1小时、1小时浸泡以脱去样品中的水分。
4■透明：以1：1的二甲苯：无水酒精浸泡1小时，再二甲苯浸泡1小时，以置换出组织块中的无水酒精。
5■浸蜡和包埋：将透明好的样品放入1：1的二甲苯：石蜡中过渡30分钟，再将
其放入装有石蜡的蜡杯中30分钟（需在温箱中将石蜡熔化后进行，温箱温度不得高于56C）将浸好蜡的组织块放入盛有熔化石蜡的纸盒内，使组织块包埋于石蜡中，迅速放在水盆中待其冷却后备用。
6■切片：将制好的组织蜡块经修切后粘附于台木后用切片机切成6」m的薄片，
薄片应该连续成蜡带壮。
7■展片和粘片：将切成的蜡带展于30C的温水中，再以1：1的鸡蛋清：甘油的混合剂为粘附剂，将组织薄片粘附于载玻片上，再将其置于37 E温箱中烘干（不少于24h）。
&脱蜡、染色程序：
8.1脱蜡：将载玻片置于二甲苯中两次，分别保持5分钟和1分钟，以脱去切片
中的石蜡成分。
8.2洗脱二甲苯：将载玻片置于95%、95%、80%、70%的酒精中各1分钟。
8.3用水洗脱酒精两次后以苏木精染色15分钟，再水洗两次。
之后，置于1%盐酸酒精（70%）（即l毫升盐酸加进70%酒精至100毫升），中10秒至1分钟。
8.4多次更换清水洗20分钟后以l%伊红溶液染色2至5分钟，之后水洗两次。
8.5脱水：按下列浓度酒精梯度脱水80%（l分钟）、95%（l分钟）、100%（2分钟）、100%（2分钟）、二甲苯（5分钟）、二甲苯（2分钟）。
8.6封藏：在样品上滴加适量封片树胶后立即将清洁的盖玻片盖上，平置于烘箱之中，于35至38 C烘干后贴上标签保存。
（详细请参照《家畜解剖学及组织胚胎学》后附2）
二、H.E染液配方
苏木精染液配法较多，常规染色多指Harris氏苏木精，配法如下：
苏木精1g,纯酒精10ml，硫酸铝铵（铵明矶）20g,蒸馏水200ml,氧化汞0.6g。
先将苏木精溶于纯酒精，硫酸铝铵放入蒸馏水加温溶解（不必沸腾），即加入溶化的苏木精醇溶液，继续加温至沸腾状态，移出火面，并在沸腾状下迅速加进氧化汞，再移进火面继续加温煮沸1分钟，即时离开火面，将烧杯移入冰水中
急骤冷却，并不停摇动，使其完全冷却后，静置过夜，次日再过滤。
在96毫升
滤液中加进4毫升冰醋酸，即可使用。
在加氧化汞时，即产生大量气体，使染液从容器内喷出，有灼伤皮肤的危险，因此加氧化剂时，容器必须离开火面。
为避免气体溅出，所用容器应尽最大些。
染液冷却后表面有一层金属状薄膜，溶液中沉淀较多，故使用前应过滤。
染色正常时，细胞核先呈棕红色，经分色后呈浅红色，流水冲洗或碱化后呈蓝色。
如染色未经水洗或碱化即呈蓝色，表示染液过氧化或因使用过久，已失去染色力，应予更换新染液。
伊红（Eosin）是一种酸性染料，能溶于水或酒精，加少许冰醋酸可增强染色力，但过久标本易于褪色。
常用配法：一般可配成0.1—1% （1 %:伊红1.0g,蒸馏水100ml.）。
伊红水溶液或酒精（70%、80%、90%选其中任一浓度均可）溶液。
若遇
伊红着色困难时，可加入几滴冰醋酸以增强伊红的染色力。
H.E染色时，应注意苏木精与伊红二者对比染色色调的协调。