植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。

整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。

我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。

该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。

二、实验的进行程序和要求1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。

2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。

3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。

在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。

有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。

5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。

在实验结束时呈交。

6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。

三、实验规则和注意事项1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。

2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。

进入实验室要按规定座位入座。

3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。

有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。

4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。

操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。

5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。

如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。

6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。

值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

实验一试剂的配制一【实验目的】掌握CTAB提取液、TAE电泳缓冲液和LB液体培养基等试剂的配制方法。

二【试剂】Tris（三羟甲基氨基甲烷）、浓HCl、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、NaOH、NaCl、冰醋酸、荧光染色剂溴化乙啶（EB）、琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、氨苄青霉素、氯仿/异戊醇（24：1）、三水乙酸钠三【仪器设备】天平、PH计、量筒、量杯、三角瓶、移液管、蓝盖瓶、玻璃棒、药勺、称量纸四【试剂配方】1M Tris-HCl (pH8.0)：配制量1L配置方法1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。

3. 加入约42mL浓盐酸调节所需要的pH值。

（浓盐酸用移液管量取）4. 将溶解定容至1L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

0.5M EDTA (pH8.0) ：配制量1L配置方法 1. 称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），置于1L烧杯中。

2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。

3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH固体颗粒）。

注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

4. 加去离子水将溶液定容至1L。

5. 高温高压灭菌后，室温保存。

CTAB提取液：配制量100mL配置方法 1. 量取10mL 1M Tris-HCl (pH8.0)，置于200mL烧杯中。

2. 加入4mL的0.5M EDTA(pH8.0)，充分搅拌。

3. 加入8.182g的NaCl，充分搅拌。

4.加入2g的CTAB，充分搅拌。

5. 用NaOH调节pH值值8.0（NaOH固体颗粒）。

注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。

6. 加去离子水将溶液定容至100mL。

7. 高温高压灭菌，冷却后加入0.2~1%的β-巯基乙醇，室温保存。

50×TAE电泳缓冲液1L（母液）：242 g Tris ，57.1 mL 冰醋酸，100 mL 0.5M EDTA（pH8.0）荧光染色剂溴化乙啶（Ethidium bromide，EB）：1gEB，100mLH2O，常温避光保存（终浓度10mg/mL，琼脂糖凝胶电泳配胶时加1滴即可）琼脂糖凝胶配置（1%）：0.2g琼脂糖，20mL TAE电泳缓冲液，加热溶解后待混合液温度降至手温时加一滴EB；LB液（固）体培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，固体培养基中加入15g琼脂粉，NaOH调PH=7.0，高温高压灭菌30分钟后，固体培养基中的抗生素于温度降至手温时加入，4 oC保存；氨苄青霉素（Amp）：将0.5g Amp，10mLddH2O，溶解后0.22 um滤膜过滤灭菌；氯仿/异戊醇（24：1）：96mL氯仿，4mL异戊醇（4oC条件下保存）；3M乙酸纳（NaAc）：40.8g三水乙酸钠NaAc.3H2O，加水定容至100mL（冰乙酸调PH至5.2）；五【实验方法】1. 固体试剂的取用规则1）要用干净的药勺取用。

用过的药勺必须洗净和擦干后才能再使用，以免沾污试剂。

（2）取用试剂后立即盖紧瓶盖。

（3）称量固体试剂时，必须注意不要取多，取多的药品，不能倒回原瓶。

（4）一般的固体试剂可以放在干净的纸或表面皿上称量。

具有腐蚀性、强氧化性或易潮解的固体试剂不能在纸上称量，应放在玻璃容器内称量。

2. 液体试剂的取用规则（1）从滴瓶中取液体试剂时，要用滴瓶中的滴管，滴管绝不能伸入所用的容器中，以免接触器壁而沾污药品。

从试剂瓶中取少量液体试剂时，则需要专用滴管。

装有药品的滴管不得横置或滴管口向上斜放，以免液体滴入滴管的胶皮帽中。

（2）从细口瓶中取出液体试剂时，用倾注法。

先将瓶塞取下，反放在桌面上，手握住试剂瓶上贴标签的一面，逐渐倾斜瓶子，让试剂沿着洁净的试管壁流入试管或沿着洁净的玻璃棒注入烧杯中。

取出所需量后，将试剂瓶扣在容器上靠一下，再逐渐竖起瓶子，以免遗留在瓶口的液体滴流到瓶的外壁。

（3）在试管里进行某些不需要准确体积的实验时，可以估计取出液体的量。

例如用滴管取用液体时，1cm相当于多少滴，5cm液体占一个试管容器的几分之几等。

倒入试管里的溶液的量，一般不超过其容积的1/3。

（4）定量取用液体时，用量筒或移液管取。

量筒用于量度一定体积的液体，可根据需要选用不同量度的量筒。

六【注意事项】配制的Tris-Hcl(pH8.0)溶液如果呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris。

配制EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。

实验二：植物总DNA的快速少量抽提和浓度测定一【实验目的】1、学习和掌握从新鲜的叶片中提取植物总DNA的操作方法2、了解分光光度计检测DNA浓度的方法二【实验原理】CTAB法简易提取DNA方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。

先用机械方法磨碎植物组织，使组织细胞破碎，然后加CTAB抽提液水浴提取DNA，最后用冰乙醇沉淀DNA即可。

DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。

波长为260nm 时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。

DNA的纯度可以通过测定260nm，230nm和280nm的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，三【试剂】CTAB抽提液、氯仿-异戊醇（24：1）、无水乙醇、70%的乙醇、ddH2O四【仪器设备及材料】仪器设备：剪刀、金属浴、离心机、1.5ml离心管、移液枪、分光光度计材料：新鲜的洋甘菊叶片五【实验步骤】1.65o C水浴预热提取液，研钵在使用前-80o C冷冻一段时间；2.取2-3g植物叶片于研钵中，加入液氮后充分研磨至粉末状后快速转入10mL离心管中，加入4mL预热提取液后上下颠倒震荡混匀，65o C水浴锅中温浴30分钟；3.加入相同体积的氯仿/异戊醇4mL，充分混匀后常温静置5分钟，4o C，12000rpm离心15分钟；4.去上清至新管，重复步骤3或可省；5.加两倍体积预冷的异丙醇或无水乙醇，缓慢充分混匀，静置3-5分钟，挑出白色絮状DNA，并用预冷70%酒精洗涤两次；6.去掉所有液体，待DNA干燥后，加入1mL灭菌过的ddH2O溶解DNA；7.加10uL10mg/mLRNase母液，37 o C温浴约30分钟，再向其中加入TE使终体积为4mL，再向其中加入4mL氯仿/异戊醇，混匀后，12000rpm离心15分钟；8.去上清至新管，依次加入1/10体积3MNaAc与两倍体积的无水乙醇，混匀后放入-20o C中静置2小时以上，挑出DNA，75%乙醇清洗2次，将DNA晾干后加500uL无菌ddH2O 溶解。

9.用分光光度计测浓度。

PCR反应时取1μL即可。

六【注意事项】尽量取材幼嫩叶片。

实验三PCR扩增技术一【实验目的】1、了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。

二【实验原理】PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。

两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。

PCR反应由一系列的变性—退火—延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA 聚合酶催化进行延伸。

由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。

理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。