酶
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
一、酶的表面修饰 （一）化学固定化：一般是直接通过酶表面的 氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上； 由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改 变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性 质发生了改变。 （二）酶的小分子修饰作用：主要是利用一些 小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的 一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、 咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分 子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。
5、吲哚基的化学修饰： 2-羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。 6、甲硫氨酸侧链基团的化学修饰： H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等 7、二硫键的化学修饰： 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。 8、酚基的化学修饰： N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、 二异丙基氟磷酸。 9、胍基的化学修饰： 丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。
表6-3 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较
酶
过氧化氢酶 核糖核酸酶 溶菌酶 胰蛋白酶 - 葡萄糖苷酶 尿激酶
修饰剂
右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 白蛋白
抗蛋白酶
抗胰蛋白酶 抗蛋白酶 抗糜蛋白酶 抗胰蛋白酶
抗抑制剂
抗失活剂
抗SDS
抗大豆抑制剂 抗尿素
——
抗胃蛋白酶 抗胎盘抑制剂
四、天然大分子对酶的修饰反应 肝素：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平 均分子量约为20，000，是一种含硫酸酯的黏多糖； 经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以 提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血 脂等活性。目前常用羰二亚胺法、三氯均嗪法和 溴化氰法活化肝素，对酶分子进行修饰。 人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亚胺法和活性 酯法对人血清蛋白进行活化，然后对酶分子进行 修饰。
第四节 修饰酶的化学性质
一、热稳定性：一般来说，经过化学修饰的酶，热稳 定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功 能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶 分子构象的稳定性（表6-1）。 二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比 较公认的是PEP和人血清白蛋白在消除酶分子抗原 性方面效果较好（表6 - 2）。
2、大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆 盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。 例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶 （SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性， 而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期， 从而提高了药效。
（四）分子内交联：增加酶分子表面的交联键 数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如 胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后， 可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性 得到改善。 （五）分子间交联：利用一些双功能或多功能 试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例 如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联 在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性； 将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化 酶可作为部分代谢途径的模型。
二、修饰反应的条件：修饰反应应尽量在酶稳定条件 下进行，并尽量不破坏酶活性必需基团，修饰率高， 活力回收要高。 （一）pH与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团 的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不 同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同 一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修 饰反应也有重要影响。 （二）修饰反应的温度与时间：严格控制反应温度和 时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。 （三）反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与修饰试剂 的比例可以控制酶分子的修饰程度。
加H2O
加酶液
E E E
亲水头部
疏水尾部
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰
（一）非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的 修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物 的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲 核的，也可以是亲电子的，还可以是是可氧化残基。 （二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰， 用蛋白酶对主联进行部分水解，可以改变酶的催化 特性。 （三）催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活 性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种 氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又 称为化学突变法。 （四）肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处 理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进 行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。
二、糖类的修饰反应： 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是 由 -葡萄糖通过 -1，6-糖苷键连接而成的高分子 多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其双羟基 经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要 的修饰方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。 糖肽（ Glycopeptide)的修饰反应: 糖肽是由人纤维 蛋白或 - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其 分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基 反应。主要方法有：2，3- 异氰酸甲苯活化法、戊 二醛法。 聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当 的还原剂可与酶分子上氨基反应。
表6-1 天然酶和修饰酶的热稳定性比较
酶
酰苷脱氢酶
修饰剂
右旋糖苷
处理条件 (℃/时间)
37/100min
残留酶活(%)
天然酶
70
修饰酶
100
胰蛋白酶
过氧化氢酶 溶菌酶 尿激酶 糜蛋白酶
右旋糖苷
右旋糖苷 右旋糖苷 人血清白蛋白 肝 素
100/30min
50/10min 100/30min 37/48h 37/24h
L-Asn 酶
- 葡萄糖苷酶
消 除
降 低 降 低
核糖核酸酶酶
三、对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶 相比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有 不同程度的提高（表6-3）。 四、修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的 半衰期得到有效延长（表6-4）。 五、最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适pH发生 了变化，这在应用上具有重要意义（表6-5）。 六、Km 的变化:有些酶经化学修饰后，Km变大， 这可能是由于屏蔽效应引起的。
第六章 酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上对酶进 行改造，以达到改构和改性的目的。在体 外将酶分子通过人工的方法与一些化学物 质，特别是一些有生物相容性的物质进行 共价连接，从而改变酶的结构和性质。这 些化学物质称为修饰试剂，酶化学修饰主 要用于基础酶学的研究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
（三）酶的大分子修饰作用：可分为非共价 修饰和共价修饰两大类： 1、大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通
过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。 例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分 子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保 护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、 多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另 外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面 的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。
三、合成大分子多聚物修饰酶 聚N - 乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为 10,000的PVP,经过开环水解,活化后,与酶结合。 聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝 基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基 共价连接。 聚丙烯醇(PAA):用分子量为250，000的PAA，经过N - 羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。 聚顺丁烯二酸酐:用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸 酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。 聚氨基酸：用分子量为5，700的聚赖氨酸做修饰剂时， 其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用 丙氨酸的二肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发 生反应。
抗SDS
表6-4 天然酶与修饰酶的半衰期比较
酶
过氧化氢酶 Arg 酶 Gln-Asn酶 尿酸酶 超氧化物岐化酶 羧肽酶
修饰剂
PEG 右旋糖苷 糖肽 白蛋白 白蛋白 右旋糖苷