溶菌酶
2010级基地班马冬珂10104109
一：溶菌酶的性质：
１９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。

紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。

（1）
溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的８—１，４键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解。

是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。

当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。

在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。

其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。

酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

二：提取原材料和提取方法:
溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中，一些植物（如卷心菜、木瓜等）的汁液中也有强力的溶菌酶活性。

目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。

提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。

鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质， (2)
提取方法：
１.蛋清中溶茵酶的提取：蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取，过程如下：蛋清过滤（９０目１００目），加入７２４型树脂吸附（每公斤蛋清加１５ｇ）一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。

用质量分数１０％硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵（３０ｇ／１００ｍＬ）沉淀溶菌酶，沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。

蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取，即在蛋清中加入食盐（ＮａＣＩ）。

使其质量分数达到５％，并调节溶液ｐＨ值至１０．０左右，加入少许溶菌酶晶体为晶种，于-４摄氏度冰箱冷却静置７ｄ一１４ｄ即可获得溶菌酶的结晶品。

这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶，收率也比较高。

可广泛用于从蛋清提取溶菌酶的工业化生产。

２.蛋壳中溶茵酶的提取：蛋壳中（实际上是蛋壳膜）溶菌酶含量虽然较低，但从变废为宝的角度考虑，仍是提取溶菌酶的重要原料。

具体工艺流程如下：蛋壳一质量分数１％ＮａＣＩ抽提滤液加热去除杂蛋白，加聚丙酸凝聚（富集），溶解凝聚物，加氯化钙沉淀上清液结晶。

三：制备（重点）：
1..酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。

研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热
以及调等电点来除卵蛋白的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。

加入磷酸盐缓冲液后经热处理和调pH值到卵蛋自等电点，沉淀中不再含有溶菌酶，实验证明加入磷酸盐缓冲液可以去除溶菌酶和卵蛋向之间的静电作用力。

研究得出去除卵蛋白效果最好的时候是在pH=7.5的磷酸盐缓冲液的条件下，100°C下热处理2min，上清中溶菌酶纯度可达到67.17%，远高于其它条件的磷酸盐缓冲液以及碳酸氢钠缓冲液条件下的处理效果。

该方法虽然简单成本低，但是也造成蛋清余液无法重复利用，加人了实际生产成本。

2.离子交换法提纯溶菌酶（实验教材所用，不作介绍）
3.超滤法提纯溶菌酶：超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大分子物质留在膜内不能透过，从而实现对酶的浓缩精制。

超滤法的优点有不易引起酶变性失活．而且操作比较方便。

溶菌酶分子量14000-15000Da，相对卵清蛋白分子量45000Da是一类分子量较小的物质。

因此本实验用截留量的膜提取溶菌酶获得了较好的效果，但是超滤法在实际操作过程中超滤时间过长，超滤膜易堵塞，这限制了它进行溶菌酶工业化生产的利用。

4.溶菌酶的磁性亲和分离：很多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。

亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。

所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。

它具有分离快速，纯化效率高。

特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。

因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。

磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。

磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。

四：性质测定：
1.酶纯度的测定：蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC等。

其中常用的电泳分析方法有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。

纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。

HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。

电泳结果分析：（1）根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。

（2）根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计算目的蛋白的分子量（以lgM对迁移率R作图，其中M为蛋白质分子量）。

2.酶活力的测定：酶活力的测定采取溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性的经典方法。

然后计算酶活力的单位：酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质8.8.8.酶含量的测定酶含量的测定酶含量的测定酶含量的测定除福林酚法外，又一方法：蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量。

取50uL的样品液加进2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm 波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。

（由标准曲线求得的回回方程为：酶样蛋白含量：b(mg/mL)=1.674×A595nm-0.0354
参考文献：
（1）溶菌酶的性质及其在食品防腐中的应用，张新宝，陈红兵; （2）溶菌酶的制备及其性质，百度文库；
（3）溶菌酶综，百度文库。