溶菌酶
溶菌酶
溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。
（一）溶菌酶的结构及物理化学性质
溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。
相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。
在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。
禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。
溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。
N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。
第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。
分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。
表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性
特性数值
相对分子质量14 400
亚基数 1
氨基酸129
等电点10.7
二硫键数 4
碳水化合物所占比例0
E1%280nm 26.4
93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110
酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解
（二）溶菌酶的来源
溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。
溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。
禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。
表17 -2溶菌酶的来源
溶菌酶的来源溶菌酶的含量
鸡蛋清 2 500 ~ 3 500μg/mL
鸭蛋清 1 000 ~ 1 300μg/mL
鹅蛋清500 ~ 700μg/mL
眼泪 3 000 ~5 000μg/mL
人乳55~ 75 μg/mL
牛奶10~ 15μg/mL
脾脏50 ~ 160μg/kg
胸腺60~ 80μg/kg
胰腺20~ 35μg/kg
花椰菜汁25~ 28μg/mL
木瓜汁8~ 9μg/mL
卷心菜汁7~8μg/mL
（三）溶菌酶的溶菌机制
溶菌酶是一种糖苷水解酶，专门作用于微生物细胞壁，可以破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4-糖苷键，其作用机理见图17 -1。
溶菌酶对革兰氏阳性菌比较敏感，而革兰氏阴性菌则不敏感，主要是因为这两种细菌的细胞壁结构不同造成的。
前者细胞壁主要由肽聚糖层组成，后者细胞壁含有大量6-D-二乙酰胞壁酸，此物质抑制溶菌酶的活性，另外革兰氏阴性菌中的肽聚糖含量低，且被含脂蛋白、酯多糖和一些疏水多肽的外膜覆盖，具有屏障作用，抑制了酶的活性，所以溶菌酶很难进入革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖层。
虽然酵母细胞壁中不含肽聚糖，但其表面含有溶菌酶可分解的另一成分——几丁质，这使得溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用。
（四）溶菌酶的提取方法
蛋清和蛋壳中溶菌酶含量较高，是工业上提取溶菌酶的主要来源。
从蛋清中提取溶菌酶的常用方法有传统的直接结晶和沉淀法、离子交换层析法、亲和色谱法、超滤法等。
对鸡蛋中溶菌酶的提取，要求提取工艺不能影响剩余蛋清的质量或功能特性。
1．结晶法
结晶法，又称等电点法盐析法，用5%的氯化钠直接通过结晶法从蛋清中分离溶菌酶。
溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，且其等电点在碱性pH范围内，而蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件。
利用这一特点，可以先加入盐类如氯化物等使溶菌酶充分溶解，过滤除去不溶性蛋白质，然后调节pH至碱性，降低温度，溶菌酶即以结晶形式慢慢析出，过滤后将结晶体溶于酸图17 -1溶菌酶的抑菌机理性水溶液，许多杂质蛋白形成沉淀析出，而溶菌酶则存留溶液之中；再次将体系pH调节至溶菌酶的等电点，静置结晶，便得到溶菌酶晶体，为
了得到高纯度的蛋白质必须进行多次的复溶和重结晶。
在先前溶菌酶分离过后，可以通过超滤和渗滤技术除去残余在蛋清的盐类。
此法原理简单，操作简便，成本低。
2．离子交换法
鸡蛋清溶菌酶是一种碱性蛋白质，在pH6.5条件下，选择弱酸性阳离子交换树脂吸附，然后用氯化钠或硫酸盐溶液洗脱，经透析再冷冻干燥而得成品。
3．亲和色谱法
将混合液通过吸附剂，酶被专一性吸附，再在一定的条件下将复合物中的吸附剂洗脱掉，能从而到纯净的酶。
这种吸附剂主要有几丁质及其衍生物（如几丁质包埋纤维素、羧甲基几丁质等）、壳聚糖等，应用时一般固定在一定载体上或直接作为柱材。
该法生产的溶菌酶纯度高。
4．超滤法
超滤法是利用膜两侧的压力差，当混合物通过超滤膜，水分、盐类及糖类等小分子透过膜，而溶菌酶等蛋白质大分子物质留在膜内不能透过，从而达到浓缩效果。
超滤膜的膜孔大小要根据被分离物质的相对分子质量大小来选择。
溶菌酶的相对分子质量为14 300ku，而蛋清中其他蛋白质的相对分子质量则在30 000ku以上，因此可选择合适膜孔，溶菌酶全部通过而其他蛋清蛋白质几乎全部截留。
一般情况下，透膜压越高，溶菌酶的纯度相对越高。
它的优点是无相变、操作简单、操作费用低、产品不易失活。
（五）溶菌酶的应用
1．在食品工业中的应用
研究发现溶菌酶能强力分解革兰氏阳性菌中的枯草芽孢杆菌和耐辐射微球菌，蛋清溶菌酶能一定程度地分解大肠杆菌、普通变形菌、副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌。
溶菌酶的抑菌溶菌机制使其具有其他防腐剂无法比拟的优点：①特异性强，作用于细菌细胞壁，尤其是革兰氏阳性菌，而不会作用于其他成分；②是一种天然的蛋白质，对人体无毒性。
然而溶菌酶也有一些缺点，如抗菌谱较窄等，使其应用受到限制。
(1)乳制品的防腐保鲜与营养强化
牛乳中溶菌酶含量相对人乳中较少，将溶菌酶添加入牛乳中，不仅可以抑制腐败微生物的生长，调节肠道菌群，还可以直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖，不仅可以延长婴儿配方奶粉的保存期，而且可以增强婴儿的免疫力。
在干酪的生产和贮藏中，添加溶菌酶可抑制微生物污染引起的酪酸菌发酵产酸产气，以保证干酪的质量。
(2)肉制品和水产品的防腐
有研究表明，溶菌酶对引起鱼贝类中毒的嗜盐菌中的副溶血性弧菌的溶菌活性，依食盐浓度不同而不同。
当食盐浓度在1%时，溶菌酶有抑菌作用；当食盐浓度为3%--5%时，溶菌酶的抑菌作用反而降低。
用溶菌酶处理活海胆、鱼卵、虾、蛤蛎肉等新鲜水产品，可延长保鲜时间。
(3)其他食品中的保鲜
在生面条、花生酱、色拉等食品中加入溶菌酶均可以起到良好的防腐保鲜作用。
使用时，除注意溶菌酶的浓度外，还要掌握食品的pH、温度、盐的浓度，向食品中添加溶菌酶的时间、方式以及溶菌酶作用的有效条件等。
现在，人们尝试将溶菌酶和其他防腐剂并用，进行防腐试验。
甘氨酸含量达到一定浓度时，能抑制微生物细胞壁的生长，所以和溶菌酶混合使用，防腐效果更好，这在奶油蛋糕、混合粉及冷冻食品上都有一定表现。
2．在医疗上的应用
口腔龋齿病原菌主要是突变链球菌，溶菌酶防止龋齿的效果很明显。
在临床应用上，溶菌酶还可以用于副鼻窦炎、口腔溃疡、扁平苔藓和渗出性中耳炎等疾病的治疗。
此外，溶菌酶做内服剂时，可抑制流行性感冒和腺病毒的生长，抗感染及抗炎症，还具有多种药理作用。
李灿鹏，吴子健主编,蛋品科学与技术,中国质检出版社,2013.04,第275页。