570～ 四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素 氨基Eu3+螯合物 550nm 490490-560nm 354nm 340nm
第二节 荧光抗体技术
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应， 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗 涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 或对自身抗体进行定性和滴度测定。 或对自身抗体进行定性和滴度测定。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 标记原理: 利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 FITC 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 FITC结合成荧光抗体 标记方法: 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 荧光素用量少，但有非特异性染色。 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。 非特异染色较低。
二、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 荧光物质
常用的荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 最大吸收光谱 490～495nm 490～ 最大发射光谱 应用 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定 黄绿色） FAT、 520～ 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT 620nm（橙红色） 620nm（橙红色） 595nm（红色） 595nm（红色） 430nm（蓝色） 430nm（蓝色） 613nm FITC的衬比染色或双标 FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、 双标记FAT、流式细胞术 FAT 双标记或多标记FAT 双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照: 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 - ：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 ：荧光较弱但清楚可见。 ++”：荧光明亮。 “++ ：荧光明亮。 +++”：耀眼强荧光。 “+++ ：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 特异荧光强度“++ 以上判定为阳性，对照光应呈“ 或 。 以上判定为阳性 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 "++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
荧光抗体的制备
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除游离荧光素及其降解产物： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体： 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备长，在不同波长下记录的样 发射光谱是指固定激发波长， 是指固定激发波长 品发射荧光的强度。 品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长， 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 是指固定检测发射波长 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
滤光片
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间， 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 保护眼睛。 保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光： 透射光：照明光线从标 本下经聚光器透过标本 进入物镜。 进入物镜。 落射光： 落射光：照明光线从标 本上经垂直照明器落射 到标本， 到标本，经标本反射进 入物镜。 入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b) 落射荧光显微镜光路(b)
stokes位移: stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 位移 镧系元素Stokes位移大(273nm) Stokes位移大(273nm)， 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm， 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm， 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
荧光标记物的相对比活性
比活性： 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000 /S激发 1000次 激发， 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
信号增强
Eu3+标记抗原 抗体复合物
酸性增强液
Eu3+解离
结合β 结合β-二酮体
-20℃：保存1～2年 20℃：保存1 真空干燥： 真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片： 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞： 培养细胞：单层培养细胞
荧光的基本知识
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下， 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、 20℃）、苯胺、 ）、苯胺 酚、硝基苯、I-等 。 硝基苯、
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝────── ＝ FH＋FL
第八章 荧光免疫技术
第一节 概述 一、荧光的基本知识 二、荧光物质
第二节 荧光抗体技术 一、标本的制作 二、荧光抗体的制备 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用 思考题 小结
标本的制作
组织切片的类型
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。
标本的制作
标本的固定和保存 标本的固定和保存
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、 保 4℃、 存：4℃、-20℃
一、时间分辨荧光免疫测定
基本原理
时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～ 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～ 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
stokes位移 stokes位移
四、荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光对 样品进行激发， 样品进行激发，产生一定波长 的荧光， 的荧光，对样品结构或其组分 进行定性、定位、 进行定性、定位、定量观察检 测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 光源：高压汞灯、 滤光片：隔热、 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 光路：透射光、 聚光器：明视野、 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头： 镜头：消色差镜头
荧光素与蛋白结合率： 荧光素与蛋白结合率： F/P=
2.87 × A495nm A280 nm 0.35 × A495nm
抗体效价： 抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度： 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence） 荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后， 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时， 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。 放出能量，称为荧光。
荧光的基本知识
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定