Excitation Filter •Single Band Pass •Dual,Triple,Quad
Brightfield
Brightfield: Condenser + Objective Fluorescence: Objective
F.I.S.H.
L - light source; E - excitation filter; CBS - chromatic beam splitter; B barrier filter; 0 - objective; C - condenser; Oc - ocular; P - preparation.
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应 时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与
FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86
个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S H H FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ H S H
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1 抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。 荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。 结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 SephadexG50或 G25 保存 4℃ ,-40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法
Golden Rules of Fluorescent Microscopy
• Ensure that filters are optimised for fluorochromes used. • Treat filters with great care. • Ensure an adequate, full spectrum, light supply. • If possible use an imaging system.
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部 不能充分激分。
(4)封片剂
常用甘油，必须无自发荧光，
无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封 片剂。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声
学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光 调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共
聚焦系统组成。
(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元 件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化
学基团，结合后不易离解，而未结合的色 素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。 (3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。 (4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。 (6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
呈橙红色荧光。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉 末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光谱570nm，最大
发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧
光，分子量580，RB200不能直接和蛋白
质结合，要先经五氯化磷反应，转化成
硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热 滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 分光镜 U 激发滤光片 截止滤光片 用途 BA420 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 DM400 BP330-385 BP360-370
Emission Filter •Single or Multi Band Pass
Wavelength
Intensity
Wavelength
Intensity
Dichroic Mirror
Intensity Wavelength
Fluorescent Light Source •100W •Mercury
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源 时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，
超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集 中检查，以节省时间，保护光源。光源关
IB G
DM505 PB460-490
BA515IF BA590 罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
BP470-490
DM570 BP510-550 BP530-550 BP480-550
IG
DM565 BP520-550
DM600 BP545-580
BA580IF
BA610IF 德克萨斯红：荧光抗体观察
Sample DNA
Probe DNA
Fluorescent In Situ Hybridization
Denature
Hybridize
Direct Label Wash & Detect
Indirect Label
How does fluorescence microscopy work?
Epi-Fluorescent Detection
记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，
湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
V
BV
DM455 BP400-410
DM455 BP400-440 BP420-440
BA455
BA475
儿茶酚胺观察
芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸
B
DM500 BP450-480
BP470-490 BP420-480
BA515
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察
吖啶橙：DNA，RNA 金胺结核杆菌
免疫荧光组化技术
主要内容
一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法
四、荧光抗体的质量鉴定
五、免疫荧光组化染色方法
六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
思考题：
1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备 方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？
发射
以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以
辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很
不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也 很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的 光能并发射荧光。
2.间接法
是直接法的重要改进，先用标
记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结 合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异
性结合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石 蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS
洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h， 或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 甘油ຫໍສະໝຸດ 蒸馏水 4.8g 12ml 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心， 15min，最后加入1.4-diazobicydo[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度 2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于20℃中。 (5)镜油
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser
scanning confocal microscope,LSCM) 是80年代发展起来的一项具有划时代意 义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层 扫描成像，从而对被检物体样品从停留到 表面单层，静态平面的观察进行到立体， 断层扫描、动态全面的观察，在生命科学 研究中得到迅速应用。
闭后必须在30min后才能再启动光源，一 天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”
为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋ ＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝