Von Kossa染色
确定细胞外基质矿化的方 法，只有成骨细胞在体外 培养时能形成矿化的细胞 外基质，一般培养至 6~8 周即可出现。原理是将矿 化基质中的磷酸盐(钙)、 碳酸盐(钙)转变为磷酸银、 碳酸银，然后用日光、紫 外线或强还原剂使其还原 为黑色的金属银。
I型胶原检测
成骨细胞可合成I型胶原， 是成熟成骨细胞的标识物 之一，免疫荧光法检测其 表达在骨细胞核周围。
体外分化
ES
EB
贴壁诱导
约5~7天后出现自主性搏动
Nestin (ectoderm )
Tubulin (ectoderm )
Troponin (mesoderm )
AFP (endoderm)
定向分化
脂肪细胞
神经元细胞
肝细胞
神经干细胞
• 广泛存在于成年或胚胎哺乳动物大脑内 • 可分化为神经元、星形胶质细胞、少突 胶质细胞。
人ES：相对松散、 扁平状集落,集 落内细胞界限隐 约可见
特异性表达
抗原
人ES 鼠ES
Oct-4
+ +
Nanog
+ +
SSEA-1
— +
SSEA-3
+ —
SSEA-4
+ —
抗原 SSEA1 SSEA3 SSEA4
人 ES/EC — +
人EG + +
猕猴 ES — —
鼠 ES/EC/ EG + —
马ES + —
鉴定方法
• 形态学：梭型、纤维样贴壁细胞 • 表面抗原：MSCs属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它表达了 间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括: ①黏附分子, 如 CD166、CD54、CD102、CD44、CD106 等。②生长因子和细胞因子受体, 如 白介素21 受体( IL-1R )、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、C干扰素受体 ( IFN-CR)、肿瘤坏死因子(TNF) -A等。③整合素家族成员, 包括CD49a、 CD49b、CD49c、CD29、CD104 等。④其他如CD90、CD105 等。不表达造血 细胞的表面标志, 如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8 等, 也不表达与 人白细胞抗原(HLA ) 识别有关的共刺激分子及主要组织相容性复合物类 分子如HLA-DR 抗原等。 • 多向分化能力：如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、 平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经 系统的神经元和神经胶质细胞
干细胞鉴定
Quality Assurance Dept. Jane Chen
Oricell TM 检测项目
• 常规检测：细菌、真菌检测；支原体检测； 内毒素检测；
• 鉴定检测：生长形态、增殖能力、诱导分 化能力、特异性抗原表达、核型分析等
常规检测
项目 细菌、真菌检测 支原体检测 检测方法 直接接种培养法 直接接种培养法 PCR法 内毒素检测 凝胶法 检测对象 培养上清液 培养上清液 细胞 培养上清液 检测标准 阴性 阴性 阴性 ≤50EU
鉴定检测共通项目
• 复苏存活率：台盼蓝拒染法--如果细胞膜不 完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变 蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为 台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
• 细胞倍增时间：生长曲线测定（计数法或MTT法）
Growth Curve 60
（1X104 ） Cell quantity
猪EG + —
鸡EG + —
鱼ES + —
+
+
+
—
—
—
—
—
碱性磷酸酶染色
染色体结构
• 核型分析：正常稳定的二倍体核型。 • 不随传代次数而改变。 • 人（46，XX/ XY ），鼠（40， XX/ XY)
人ES核型分析：46，XX
鼠ES核型分析：40，XY
全能性
• 体内：畸胎瘤实验 • 体外：去除饲养层细胞 拟胚体（EB, embryoid body。为ES 细胞悬浮生长自发 分化形成，含有内中外三个胚层组织，能 模拟体内的发育过程) 贴壁诱导 特定条件诱导/自然分化（除去LIF） 各 胚层特定抗体免疫组化检测
形态学
梭形、纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：均质、旋涡状排列
Human
Rat
Mouse
Dog
Monkey
Rabbit
表面抗原（流式鉴定）
1.人骨髓间质干细胞
名称 检验标准 结论 CD14 ≤5 % 阴性 CD45 ≤5 % 阴性 CD44 ≥70 % 阳性 CD29 ≥70 % 阳性 CD105 ≥70 % 阳性
• 生长增殖要求
细胞类别 间质干细胞 复苏存活率 ≥80 % 增殖速度 按1:3分种率，2～3天可 传代 细胞密度(个/cm2） 人：1.5~2.5X104 大鼠：6x103 小鼠：8x103 兔：2~3x104 狗：1.5~2.5X104 5~10X104 1~5X104 1.5X105
小鼠胚胎干细胞 人胚胎干细胞 大、小鼠神经干细 胞
大鼠神经干细胞-贴壁培养
小鼠神经干细胞-贴壁培养
小鼠神经干细胞-贴壁培养
特异性抗原表达
• ≥ 75% positive for nestin (neural stem cell marker)； • ≤ 10% positive for β3-tubulin (neuronal marker)；≤ 10% positive for GFAP (astrocyte marker)； • ≤ 10% positive for GalC or oligodendrocyte specific protein OSP (oligodendrocyte marker
成骨诱导
• 诱导原理：
地塞米松：通过促进Cbfal mRNA（核心结合因子-1） 和Osterix mRNA（成骨分化必需转录因子）的表达而促进 骨髓基质细胞向成骨细胞分化。 β-甘油磷酸钠：提供磷离子作为ALP 作用的底物，诱导 和激活ALP，促进有机磷向无机磷转化，为钙盐矿化沉积 提供条件。 Vc：一种重要的营养素和氧化还原剂，在骨盐代谢及骨形 成中具有重要作用。在体外，它能增加钙盐的沉积，促进 矿化结节的形成。
体内分化
将细胞注射入（约106个） SCID（重症联合免疫缺陷） 或裸鼠体内，约4周后（人 ES可能需要8~10周），可见 细胞注射处有肿块生成，处 死小鼠，肿瘤固定后做石蜡 包埋，切片，普通HE染色后 观察。 ES可在小鼠体内生 长、分化、形成含有三个胚 层来源的良性畸胎瘤。
畸胎瘤
外胚层：鳞状上皮、神经组织等 中胚层：骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等 内胚层：柱状上皮、肠管样组织等
成骨诱导检测方法
茜素红染色
成骨诱导过程中钙离子以 钙盐的方式沉淀下来，形成 “钙结节” ，茜素红和钙发生 显色反应，产生一种深红色 的带色化合物，这样成骨诱 导的细胞外沉积的钙结节也 就被染成深红色。
碱性磷酸酶染色
碱性磷酸酶活性是成骨细胞 分化成熟的重要标志。BCIP/NBT 是碱性磷酸酯酶的常用底物。 在其催化下， BCIP会被水解产生 强反应性的产物，该产物会和NBT 发生反应，形成不溶性的深蓝色 至蓝紫色的NBT-formazan。
4.大鼠脂肪间质干细胞
名称 检验标准 结论 CD34 ≤5 % 阴性 CD45 ≤5 % 阴性 CD11b ≤5 % 阴性 CD106 ≤5 % 阴性 CD44 ≥70 % 阳性 CD29 ≥70 % 阳性 CD90 ≥70 % 阳性
诱导分化能力
• 成骨：茜素红染色 • 成脂：油红O染色 • 成软骨：阿利辛蓝/甲苯胺蓝染色
50 40 30 20 10 0 1 2 3 4
Day
5
6
7
细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期，细胞传代、实验等多应在此区间进行。 可在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间，即倍增时间。
• 细胞周期测定： 碘化丙锭(PI)染色流式检测法
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同，通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞 的DNA 含量(2N) ，而G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ，而S 期的DNA含量 介于二倍体和四倍体之间。因此，可通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进 行检测，由此可知细胞周期的分布情况并确知细胞的倍体是否正常。
成软骨诱导方法
贴壁诱导：后续检测较为简便， 但不适用于增殖过快或贴壁性 较差的细胞。
三维培养法：能容纳高密度的细胞 （与胚胎体内软骨发育的过程类似）， 细胞外基质也可良好地固定在细胞附 近，细胞之间的粘附、增殖，有利于 细胞间信号传导，为维护细胞的代谢 活动提供适宜的微环境。可以说，在 离心管三维培养法中细胞外基质对细 胞增殖分化及代谢的调节作用得到了 充分地发挥，是构建组织块的良好方 法。但后续需做石蜡切片后方可进行 染色鉴定，较为繁琐。
成脂诱导检测方法
• 油红O染色 成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有滴的累积， 并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。
Oil Red O染色的方法是对油滴的染色的一效果
Human
Rat
Mouse
Rabbit
成软骨诱导
• 诱导原理
TGF- β可促进软骨细胞基质的合成代谢，诱导间质细胞 形成软骨前增加软骨前体细胞的凝聚，使软骨的形成增加， 促进软骨基质的合成、分泌。但它的诱导作用与剂量相关， 且与地塞米松、维生素C有协同作用，从而对软骨的生长代 谢起调控作用。
鉴定方法
• 形态学特征：可做悬浮培养或贴壁培养 • 特异性抗原表达：Nestin • 分化能力：神经元、星形胶质细胞、少突 胶质细胞