．1神经干细胞的原代培养
1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也
可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。

2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，
充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操
作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显
微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔
组织后，放入D．Hanks液中冲洗。

．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，
用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。

收集细胞悬液后先后在100目和200
目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。

4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数
板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。

5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。

(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)
．2神经干细胞的传代
大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d
后成为悬浮生长的神经球。

将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心
5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞
悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。

同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。

Nestin免疫组化检测步骤：
1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；
2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；
3)PBS浸洗3min 2次，去上清；
4)Triton液破膜10 min；
5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细
胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。

自然干燥，让细
胞贴在载玻片上；
6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶；
7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。

甩去多余液体，不洗；
8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。

C过夜。

PBS
洗2 min 3次；
9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min；
10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3
次，每次5min；
11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；
研究论文
12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸
酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。

13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲。